付寶軍,姜靜靜,黃玉瓊,林宗航,李 恒

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院·清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院 麻醉科,廣東 廣州511518)

隨著我國惡性腫瘤發(fā)病率的逐年增高，抗腫瘤藥物在臨床藥物治療中扮演著越來越重要的角色，但是這些藥物引起的近期和遠(yuǎn)期毒副作用也在不斷增加，其中化療藥物如長春堿類、鉑類及紫杉醇類等引起的神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic pain NP)是極其常見的不良反應(yīng)之一。化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛(Chemotherapy-induced Neuropathic Pain,CINP)可表現(xiàn)為痛覺超敏(allodynia)和痛覺過敏(hyperalgesia)[1]。目前，由于CINP的機(jī)制尚不明確，國內(nèi)外均尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療藥物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞活化在CINP發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，激活的膠質(zhì)細(xì)胞繼而促進(jìn)TNF-α、IL-6等炎性因子的產(chǎn)生和釋放,這些促炎因子增強(qiáng)神經(jīng)元的敏感性，誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛[2,3]。丹參酮IIA(Tanshinone IIA)是從傳統(tǒng)中藥丹參中提取的脂溶性成分之一，是近年來國內(nèi)外學(xué)者對中藥單體中研究較多、最為穩(wěn)定、且有明確的分子結(jié)構(gòu)的有效活性成分，最近研究發(fā)現(xiàn)丹參酮有明顯鎮(zhèn)痛效應(yīng)[4,5]，并且丹參酮IIA通過抑制免疫反應(yīng)和膠質(zhì)細(xì)胞活化提高脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠機(jī)械縮足反射閾值和延長熱縮足反射潛伏期[6]?；谝陨献C據(jù)，本研究采用化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛模型，探討丹參酮 IIA對化療痛維持期的抑制作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑實驗采用SPF級健康Sprague-Dawley大鼠，由廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[(動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2014-0012)]。所有實驗操作程序均經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利與應(yīng)用委員會批準(zhǔn)，遵守國際衛(wèi)生學(xué)會《實驗動物福利和應(yīng)用指南》。抗GFAP和OX42抗體購于美國Abcam公司，抗β-actin抗體購于谷歌生物科技有限公司，TNF-α、IL-6ELISA試劑盒購于武漢博士德生物科技有限公司，注射用硫酸長春新堿購于浙江海正藥業(yè)股份有限公司，Tanshinone IIA注射液購于江西國藥有限公司。

1.2 長春新堿動物模型的制備及給藥方法證實成功誘導(dǎo)化療痛Sprague-Dawley大鼠50只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：對照組(Control)、化療痛組(CINP)、Tanshinone IIA 10 mg/kg組(CINP+Tan10)、Tanshinone IIA 20 mg/kg 組(CINP+Tan20)、Tanshinone IIA 50 mg/kg組(CINP+Tan500)，每組10只。大鼠進(jìn)行隔日腹腔注射125 μg/kg長春新堿(共計7次)，第1次注射長春新堿當(dāng)天視為1 d，于第7天通過檢測MWT和TWL變化確定化療藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛模型(對照組大鼠除外)建立是否成功。從第8天開始連續(xù)7天采用不同劑量的Tanshinone IIA治療大鼠。對照組和化療痛組用生理鹽水(腹腔注射劑量5 ml/kg)作為對照。給藥前、給藥后1、7、10、14天用von frey測痛儀和熱刺痛儀分別測定大鼠MWT和TWL；給藥后14天Western Blot方法檢測GFAP蛋白和OX42蛋白表達(dá)；ELISA檢測脊髓TNF-α、IL-6濃度變化。

1.3 MWT的測定用von Frey纖維絲以up-down法推算50%縮足閾值[7]：將一有機(jī)玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm)置于金屬篩網(wǎng)上,待大鼠在有機(jī)玻璃箱中適應(yīng)15 min后,用von Frey纖維絲垂直刺激大鼠后肢足底中部,持續(xù)時間≤4 s,大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應(yīng),否則為陰性反應(yīng)。測定首先從2 g開始,當(dāng)該力度的刺激不能引起陽性反應(yīng),則給予相鄰大一級力度的刺激;如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相鄰小一級力度的刺激,如此連續(xù)進(jìn)行,直至出現(xiàn)第一次陽性和陰性反應(yīng)的騎跨,再連續(xù)測定4次。最大力度為15 g,大于此值時記為15 g。每次刺激間隔30 s。

1.4 TWL的測定將有機(jī)玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上,按Hargreaves法[8]用熱痛刺激儀照射大鼠足底。照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避時為TWL。自動切斷時間為20 s,以防止組織損傷。熱刺激強(qiáng)度在整個實驗過程中維持一致。每只動物測定5次,每次間隔3 min,取后3次平均值為大鼠TWL值[9]。

1.5 Western Blot檢測烏拉坦麻醉，斷頭處死大鼠，冰上取出脊髓腰膨大部位，加入裂解液進(jìn)行勻漿，4℃下12 000 rpm離心5 min，并進(jìn)行BCA蛋白定量。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠，濃縮膠電泳條件為80伏恒壓，分離膠電泳條件為120伏恒壓，當(dāng)溴酚藍(lán)染料前端電泳至分離膠末端處時即停止電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉2 h，加入-Actin(兔抗大鼠，1∶2 000)，P38MAPK(小鼠抗大鼠，1∶1 000)，GFAP (小鼠抗大鼠，1：500)，OX42 (兔抗大鼠，1∶500)，4℃9陣育 過夜后TBST洗膜3次，每次10 min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶3000)，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶2 000)室溫孵育2 h后TBST洗膜4次，每次10 min。ECL反應(yīng)、顯、定影后使用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 ELISA檢測脊髓TNF-α、IL-6濃度變化大鼠深麻醉(大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg)后，在冰上迅速取出脊髓腰膨大段(L4-5)，按按組織凈重(g)：稀釋液體積(mL)=1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水。勻漿后于4℃,3500 r/min下離心10 min(離心半徑5 cm)，提取上清液并在80℃保存。按試劑盒說明書檢測蛋白并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1 Tanshinone IIA對大鼠運動行為的影響

Tanshinone IIA(10 mg/kg、20 mg/kg、50 mg/kg)連續(xù)腹腔注射4天對正常大鼠運動行為無影響。結(jié)果見圖1。

2.2 Tanshinone IIA對化療痛維持期大鼠MWT的影響

給藥前各組大鼠的MWT差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組相比，腹腔注射長春新堿4次后(7天)，大鼠MWT均顯著性降低(P<0.001)，并且一直持續(xù)到本實驗觀察時間點14天，提示長春新堿誘導(dǎo)化療痛大鼠模型成功。與化療痛組相比較，應(yīng)用Tanshinone IIA劑量組(20 mg/kg、50 mg/kg)治療3、7天，大鼠MWT明顯升高(P<0.01,P<0.001)，并且兩個劑量組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而Tanshinone 10 mg/kg組有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)表明Tanshinone IIA能減輕化療痛維持期大鼠的機(jī)械痛覺過敏，結(jié)果見圖2。

圖1 丹參酮IIA對正常大鼠運動行為的影響

The score of each group was normalizd as the precentage of the baseline value(n=4/goup).Control,normal rats;Tan10,normal rats treated with tanshinone IIA 10mg/kg;Tan20,normal rats treated with tanshinone IIA 20 mg/kg;Tan50,normal rats treated with tanshinone IIA 50 mg/kg.

圖2 丹參酮IIA對長春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠機(jī)械縮足反射閾值的影響

###P<0.001 compared with CINP group;*P<0.05 and**P<0.01 compared with CINP+Tan20 group.Control,normal rats;CINP,vincristine-induced neuropathic pain rats treated with vehicle;CINP+Tan10,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 10mg/kg;CINP+Tan20,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 20mg/kg;CINP+Tan50,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 50 mg/kg.

2.3 Tanshinone IIA對化療大鼠維持期TWL的影響

給藥前各組大鼠的TWL差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組相比，腹腔注射長春新堿4次后(7天)，大鼠MWT均顯著性降低(P<0.001)，并且一直持續(xù)到本實驗觀察時間點14天，提示長春新堿誘導(dǎo)化療痛大鼠模型成功。與化療痛組相比較，應(yīng)用Tanshinone IIA劑量組(20 mg/kg、50 mg/kg)治療3、7天，大鼠TWL明顯升高(P<0.01,P<0.001)，并且兩個劑量組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但Tanshinone10 mg/kg組有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示Tanshinone IIA可以減輕化療痛維持期大鼠的熱痛覺過敏。結(jié)果見圖3。

圖3 丹參酮IIA對長春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠熱縮足反射潛伏期的影響

###P<0.001 compared with CINP group;*P<0.05 and**P<0.01 compared with CINP+Tan20 group.Control,normal rats;CINP,vincristine-induced neuropathic pain rats treated with vehicle;CINP+Tan10,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 10 mg/kg;CINP+Tan20,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 20 mg/kg;CINP+Tan50,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 50 mg/kg.

2.4 Tanshinone IIA對化療痛維持期大鼠脊髓GFAP蛋白表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示：與對照組相比，腹腔注射長春新堿7次(14天)化療痛組大鼠脊髓GFAP表達(dá)顯著升高(P<0.01)，與化療痛組相比，Tanshinone IIA 50 mg/kg組和Tanshinone IIA 20 mg/kg組大鼠脊髓GFAP表達(dá)則明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且Tanshinone IIA 50 mg/kg組和Tanshinone IIA 20 mg/kg兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Tanshinone IIA 10 mg/kg組雖有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示Tanshinone IIA可以抑制化療痛維持期大鼠脊髓GFAP的表達(dá)。結(jié)果見圖4。

2.5 Tanshinone IIA對化療痛維持期大鼠脊髓OX42蛋白表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示：與對照組相比，腹腔注射長春新堿7次(14天)后化療痛組、Tanshinone IIA 10 mg/kg組、Tanshinone IIA 20 mg/kg組、Tanshinone IIA 50 mg/kg組大鼠脊髓OX42蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示Tanshinone IIA不能抑制化療痛維持期大鼠脊髓OX42蛋白的表達(dá)或者提示化療痛組大鼠脊髓OX42蛋白表達(dá)與基礎(chǔ)值相當(dāng)，結(jié)果見圖5。

圖4 丹參酮IIA對長春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓GFAP表達(dá)的影響

#P<0.05 and##P<0.001 compared with CINP group;**P<0.01 compared with Control group.Control,normal rats;CINP,vincristine-induced neuropathic pain rats treated with vehicle;CINP+Tan10,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 10 mg/kg;CINP+Tan20,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 20 mg/kg;CINP+Tan50,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 50 mg/kg.

圖5 丹參酮IIA對長春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓OX42表達(dá)的影響

Control,normal rats;CINP,vincristine-induced neuropathic pain rats treated with vehicle;CINP+Tan10,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 10mg/kg;CINP+Tan20,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 20 mg/kg;CINP+Tan50,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 50 mg/kg.

2.6 Tanshinone IIA對化療痛維持期大鼠脊髓TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)的影響

ELISA結(jié)果顯示：與對照組相比，腹腔注射長春新堿7次(14天)后化療痛組大鼠脊髓TNF-α、IL-6表達(dá)顯著升高(P<0.01)，與化療痛組相比，Tanshinone IIA 50 mg/kg組和Tanshinone IIA 20 mg/kg組大鼠脊髓TNF-α、IL-6表達(dá)明顯降低(P<0.05，P<0.01)，Tanshinone IIA 10 mg/kg組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示Tanshinone IIA可以抑制化療痛維持期大鼠脊髓TNF-α、IL-6的表達(dá)。結(jié)果見圖6，圖7。

圖6 丹參酮IIA對長春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓TNF-α表達(dá)的影響

##P<0.01 compared with CINP group;*P<0.05 and**P<0.01 compared with Control group(n=5/group).Control,normal rats;CINP,vincristine-induced neuropathic pain rats treated with vehicle;CINP+Tan10,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 10mg/kg;CINP+Tan20,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 20 mg/kg;CINP+Tan50,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 50 mg/kg.

3 討論

化療藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛其機(jī)制至今仍不完全清楚，因此缺乏有效治療手段。盡管如此，藥物治療在治療手段中占有很大比重，目前，已嘗試的治療藥物主要有：阿片類藥物嗎啡、局部治療藥物5%利多卡因貼劑、抗驚癲癇藥加巴噴丁和三環(huán)類抗抑郁藥阿米替林。

阿片類藥物鎮(zhèn)痛藥強(qiáng)，但由于其依賴性和戒斷性、惡心嘔吐和呼吸抑制等副作用限制在化療藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛患者中應(yīng)用[10]；5%利多卡因貼劑其局限性為應(yīng)用于定位比較明顯的神經(jīng)病理性疼痛[11]；抗癲癇藥物加巴噴丁治療化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛患者研究結(jié)果有很大分歧[12-14]，因此此類藥物用于化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的治療仍需進(jìn)一步探討；三環(huán)類抗抑郁藥阿米替林可減輕糖尿病性神經(jīng)病理性疼痛因其心臟毒性患者無法耐受。因此，迫切開發(fā)和尋找新的藥物治療化療藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛藥物具用重大意義。

圖7 丹參酮IIA對長春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓IL-6 表達(dá)的影響

#P<0.05 and##P<0.01 compared with CINP group;*P<0.05 compared with Control group(n=5/group).Control,normal rats;CINP,vincristine-induced neuropathic pain rats treated with vehicle;CINP+Tan10,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 10 mg/kg;CINP+Tan20,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 20 mg/kg;CINP+Tan50,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 50 mg/kg.

丹參酮IIA是丹參酮(是中藥丹參根的脂溶性成分)中含量最高，活性最為穩(wěn)定的成份，分子結(jié)構(gòu)明確有抗氧化和抗炎作用，并且對心腦血管疾病、腫瘤等疾病有潛在治療作用。丹參酮IIA的鎮(zhèn)痛作用已在脊神經(jīng)結(jié)扎模型、糖尿病神經(jīng)病理痛模型、骨癌痛模型中得到證實，但在化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中應(yīng)用還未見報道，本研究行為學(xué)顯示：腹腔注射長春新堿4次后，證實穩(wěn)定化療痛模型制作成功，在繼續(xù)使用長春新堿的同時，加用丹參酮IIA治療，連續(xù)給藥7天后，大鼠的熱痛閾值和機(jī)械痛閾值明顯提高，我們初步證實：丹參酮IIA在化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用；并且發(fā)現(xiàn)連續(xù)丹參酮IIA治療7天，不僅產(chǎn)生穩(wěn)定的抗痛敏效應(yīng)，同時尚未發(fā)生類似阿片類藥物長期治療產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛耐受。最近研究顯示：丹參酮IIA通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化和免疫反應(yīng)，削弱脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠機(jī)械痛敏和熱痛敏，但是丹參酮IIA是否通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化在化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛模型中發(fā)揮抗痛敏效應(yīng)？Westem blotting結(jié)果顯示：在丹參酮IIA治療7天后，化療痛大鼠脊髓星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP蛋白表達(dá)顯著升高，小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物OX42蛋白表達(dá)在不同組之間變化一致；而丹參酮IIA各劑量組大鼠脊髓GFAP蛋白表達(dá)明顯少于化療痛組。已有研究表明：小膠質(zhì)細(xì)胞激活在神經(jīng)病性疼痛的形成期發(fā)揮作用；而星型膠質(zhì)細(xì)胞激活在在神經(jīng)病性疼痛的維持期發(fā)揮作用，本研究時間段恰恰是長春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的維持期，因此，很可能在本實驗?zāi)Ｐ椭?，我們研究時間段小膠質(zhì)細(xì)胞沒有被激活，星型膠質(zhì)細(xì)胞激活占主導(dǎo)，導(dǎo)致對照組、化療痛組、Tanshinone IIA 10 mg/kg組、Tanshinone IIA 20 mg/kg組、Tanshinone IIA 50 mg/kg組大鼠脊髓OX42蛋白表達(dá)差異相當(dāng)，但長春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的形成期是否小膠質(zhì)細(xì)胞被激活占優(yōu)勢還有待于實驗進(jìn)一步證實。

膠質(zhì)細(xì)胞的激活促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-6等的合成和釋放，產(chǎn)生的促炎癥因子可參與興奮性氨基酸或其受體的調(diào)控，同時促炎癥因子還可介導(dǎo)神經(jīng)突觸信號傳遞及影響神經(jīng)纖維的電位時程，參與中樞敏化的形成。ELISA結(jié)果顯示，在使用丹參酮IIA治療7天后，化療痛組大鼠脊髓TNF-α、IL-6表達(dá)顯著升高，丹參酮IIA各劑量組脊髓TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)明顯少于模型組，以上結(jié)合ELISA、Westem blotting結(jié)果推測：化療痛組大鼠脊髓TNF-α、IL-6表達(dá)顯著升高可能由激活星型膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放TNF-α、IL-6增加，介導(dǎo)長春新堿誘導(dǎo)的痛敏形成，而Tanshinone IIA作用的靶點恰恰是激活星型膠質(zhì)細(xì)胞，抑制TNF-α、IL-6合成和釋放，產(chǎn)生抗痛敏效應(yīng)。但Tanshinone IIA是否通過抑制TNF-α、IL-6影響神經(jīng)突觸信號傳遞及神經(jīng)纖維的電位時程來發(fā)揮抗痛敏效應(yīng)，還有待于實驗進(jìn)一步證實。

總之，在本實驗條件下，丹參酮IIA能夠抑制長春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛，其作用的機(jī)制可能與其抑制大鼠脊髓星型膠質(zhì)細(xì)胞活化，進(jìn)而減少炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-6的表達(dá)相關(guān)。