翁繩鳳,邢俊蓬,郭 威

(1.北京老年醫(yī)院 檢驗(yàn)科;2.北京老年醫(yī)院 感染疾病科,北京100095)

結(jié)核病疫情嚴(yán)峻,但由于其臨床癥狀和體征不典型,診斷和鑒別診斷較困難,導(dǎo)致漏診和誤診率較高,因此迫切需要快速簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷方法,指導(dǎo)臨床早期診斷。近年來,基于γ-干擾素體外釋放試驗(yàn)建立起來的免疫學(xué)檢測(cè)手段,在診斷結(jié)核分枝桿菌感染方面顯示出良好的敏感性和特異性[1]。血清學(xué)(抗原、抗體、蛋白芯片)檢測(cè)依然是結(jié)核病輔助診斷的重要手段之一[2],主要是操作簡(jiǎn)便,快速實(shí)用。這些手段對(duì)結(jié)核病診斷價(jià)值備受學(xué)者的廣泛關(guān)注,為進(jìn)一步了解結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)和結(jié)核抗體試劑盒在診斷結(jié)核病的應(yīng)用價(jià)值,本研究通過回顧性分析,對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)結(jié)核抗體檢測(cè)和T-spot.TB試驗(yàn)在結(jié)核病診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1研究對(duì)象 回顧性分析2015.11-2016.11期間疑似結(jié)核的住院患者臨床資料(544例)。其中菌陽(yáng)肺結(jié)核患者210例(均通過細(xì)菌學(xué)診斷確診),平均年齡(62.93±20.37)歲；菌陰肺結(jié)核患者268例(均通過臨床進(jìn)行診斷),平均年齡(64.80±20.30)歲；非結(jié)核菌病患者66例,平均年齡(69.98±17.89)歲。三組患者同時(shí)進(jìn)行過T-spot.TB,TB-DOT和ASSURE TB結(jié)核抗體檢測(cè)。

1.1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) (1)菌陽(yáng)肺結(jié)核診斷參照原衛(wèi)生部《WS288-2008肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》[3]執(zhí)行。(2)菌陰肺結(jié)核：以中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》[4]為依據(jù)，3次痰涂片及一次痰培養(yǎng)均為陰性的肺結(jié)核,具體診斷標(biāo)準(zhǔn)是1)典型的肺結(jié)核臨床癥狀和胸部x線表現(xiàn)；2)抗結(jié)核藥物治療有效；3)臨床可排除其他非結(jié)核性肺部疾??；4)PPD(5IU)皮膚試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性,血清抗結(jié)核抗體陽(yáng)性；5)痰結(jié)核分枝桿菌PCR探針檢測(cè)陽(yáng)性；6)肺外組織病理證實(shí)為結(jié)核病變；7)支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢出抗酸分枝桿菌；8)支氣管或肺部組織病理證實(shí)結(jié)核病變。具備1-6條中的三項(xiàng)或7-8條中任何一項(xiàng)可確診。(3)非結(jié)核病患者,排除結(jié)核病診斷的呼吸系統(tǒng)疾病患者,包括肺炎,支氣管擴(kuò)張,慢性支氣管炎,慢性阻塞性肺部疾病及肺惡性腫瘤,診斷參照《實(shí)用內(nèi)科學(xué)》[5]執(zhí)行。

1.2 試驗(yàn)及方法

1.2.1T-spot.TB試驗(yàn) 試劑盒是由英國(guó)Oxord Immunotec 公司生產(chǎn)。

①標(biāo)本要求 采集外周全血4 ml,無(wú)需空腹,需用肝素/肝素鈉抗凝,不能使用EDTA抗凝管；樣本要求新鮮(在8 h內(nèi)完成實(shí)驗(yàn))；室溫保存與運(yùn)輸；不能冷凍或冷藏；避免震蕩引起溶血影響結(jié)果。

②外周血T淋巴細(xì)胞分離 抽取外周靜脈血4 ml至肝素鈉抗凝的無(wú)菌管,混勻,避免血液分層。緩緩加入到等體積的淋巴分離液的無(wú)菌離心管中,離心1 600×g 30 min,可見外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)存在于云霧層中,吸取淋巴細(xì)胞層,用1640培養(yǎng)液洗滌離心2次。顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù),用細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)至細(xì)胞數(shù)2.5×106/ml。

③結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)試劑盒說明書,如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)(SFC)<6,檢測(cè)孔SFC減去陰性對(duì)照孔SFC≥6,可判讀為陽(yáng)性,<6判讀為陰性。如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)(SFC)≥6,檢測(cè)孔SFC為陰性對(duì)照孔2倍時(shí),可判讀為陽(yáng)性。

1.2.2結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)

①TB-DOT檢測(cè) 試劑盒由上海奧普生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn),可定性檢測(cè)人血清中結(jié)核分枝桿菌抗體,用于臨床結(jié)核病輔助診斷。

本試劑盒利用斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾技術(shù),將結(jié)核分枝桿菌特異性膜蛋白抗原分離純化,點(diǎn)樣并固化在硝酸纖維膜上,膜上TB抗原捕獲人血清樣品中結(jié)核分枝桿菌抗體,被捕獲的結(jié)核IgG抗體可用葡萄球菌A蛋白(SPA)膠體金綴合物標(biāo)記呈色(SPA能與IgG特異性結(jié)合),形成紅色斑點(diǎn),根據(jù)是否出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)即可判斷陰陽(yáng)結(jié)果,從而判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌抗體。

②ASSURE TB檢測(cè) 試劑盒由新加坡MP生物醫(yī)學(xué)亞太私人有限公司生產(chǎn)ASSURE TB(膠體金法),用于定性檢測(cè)人血清、血漿或全血中的結(jié)核分枝桿菌IgG抗體。

本試劑盒(MP Diagnostice (MPD)ASSURE TB Rapid Test)應(yīng)用間接固相免疫層析技術(shù),當(dāng)檢測(cè)樣本從樣本孔向上遷移時(shí),固定在膜上的結(jié)核抗原會(huì)與試驗(yàn)樣本(血清、血漿或全血)中的特異性抗體形成抗原-抗體復(fù)合物。這種復(fù)合物與標(biāo)記有相應(yīng)二抗的膠體金結(jié)合,形成肉眼可見的紫紅色條帶,質(zhì)控線上的蛋白A也同時(shí)與金標(biāo)二抗結(jié)合作為樣本正確加入的標(biāo)記。如果在檢測(cè)線處(T)和質(zhì)控線處(C)出現(xiàn)紫色條帶,則結(jié)核分枝桿菌抗體為陽(yáng)性。任何深度的條帶均應(yīng)判作陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,應(yīng)用卡方檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況544例患者中,男253例,女291例。菌陽(yáng)組210例,年齡19-93(歲),平均年齡(62.93±20.37)歲；菌陰組268例,年齡18-94(歲),平均年齡(64.80±20.30)歲；對(duì)照組66例,年齡21-94(歲),平均年齡(69.98±17.89)歲。三組在性別和年齡上差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05。

2.2 檢測(cè)結(jié)果三組患者采用T-spot TB和兩種結(jié)核抗體金標(biāo)試劑進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見表1。菌陽(yáng)肺結(jié)核患者 210例,其中Tspot-TB檢測(cè)陽(yáng)性率為84.28%(177/210),TB-DOT為64.28%(135/210),ASSURE TB為62.85%(132/210)。菌陰肺結(jié)核患者268例,其中Tspot-TB檢測(cè)陽(yáng)性率為76.87%(206/268),TB-DOT為44.77%(120/268),ASSURE TB為39.55%(106/268)。Tspot-TB檢測(cè)方法的陽(yáng)性率與兩種抗體檢測(cè)方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P均為0.000,見表2。兩種結(jié)核抗體檢測(cè)方法的陽(yáng)性率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.210,P=0.3)。對(duì)照組66例患者中,檢測(cè)特異性分別為Tspot-TB 78.79%(52/66),TB-DOT 77.27%(51/66),ASSURE TB 75.76%(50/66),三種方法特異性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.173,P=0.917)。

表1 不同組別患者采用T-spot TB和兩種結(jié)核抗體金標(biāo)試劑的檢測(cè)結(jié)果

表2 T-spot TB試劑盒與兩種結(jié)核抗體試劑盒檢測(cè)結(jié)核病組與對(duì)照組患者的診斷價(jià)值

注：表中的χ2值、P值分別為兩種結(jié)核抗體檢測(cè)靈敏度與T-spot TB靈敏度的比較結(jié)果

3 討論

全球20億人口感染結(jié)核[6],現(xiàn)有活動(dòng)性結(jié)核患者2000萬(wàn),新增活動(dòng)性結(jié)核患者約900萬(wàn)/年,每年200-300萬(wàn)患者死亡。我國(guó)是22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一,結(jié)核病早期診斷,早期規(guī)范治療尤為重要。由ELISPOT發(fā)展而來的T-spot TB試驗(yàn)是用于檢測(cè)特異性T細(xì)胞分泌的γ-干擾素,并據(jù)此判斷是否感染結(jié)核分枝桿菌。劉紅等[7]對(duì)1084例疑似肺結(jié)核患者進(jìn)行研究,T-spot TB綜合敏感度為86.2%,特異度為91.1%；萬(wàn)榮等[8]研究中顯示168例結(jié)核病患者T-spot TB綜合敏感度為86.9%；T-spot TB對(duì)免疫功能正常的成年人活動(dòng)性結(jié)核病診斷的敏感度為83%-97%,綜合敏感度90%[9,10]。本研究478例結(jié)核病患者T-spot TB診斷的綜合敏感度為80.13%,略低于上述報(bào)道,可能是因?yàn)椴±蠖嗍抢夏耆?老年肺結(jié)核患者機(jī)體免疫功能相對(duì)低下且多有合并癥,可能影響T-spot TB敏感度[8]。T-spot TB在非結(jié)核病組中的陰性率為78.79%,低于國(guó)內(nèi)外其他研究[7-10],可能與患者年齡及例數(shù)多少有關(guān)。

T-spot TB對(duì)菌陽(yáng)肺結(jié)核和菌陰肺結(jié)核患者的檢測(cè)敏感度分別為84.28%和76.27%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05。結(jié)核抗體試劑盒TB-DOT對(duì)菌陽(yáng)肺結(jié)核和菌陰肺結(jié)核患者的檢測(cè)敏感度分別為64.28%和44.77%；ASSURE TB分別為62.85%和39.55%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05,有利于結(jié)核病療效的監(jiān)測(cè)。這與劉毅[11]等報(bào)道的38 kDa蛋白血清抗體檢測(cè)在診斷活動(dòng)性肺結(jié)核上有較好的診斷和應(yīng)用價(jià)值的結(jié)果一致。TB-DOT檢測(cè)主要針對(duì)外膜抗原,ASSURE TB檢測(cè)主要針對(duì)38 kDa抗原(相對(duì)分子質(zhì)量為38000的抗原,簡(jiǎn)稱為“38 kDa抗原”),而T-spot TB試驗(yàn)是針對(duì)早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP10)。

T-SPOT.TB與兩種抗體檢測(cè)方法在診斷結(jié)核病敏感性的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),尤其對(duì)菌陰患者有顯著差異(76.87% vs 44.77%和39.55%)。T-spot TB試驗(yàn)在結(jié)核感染的檢出方面具有較高的靈敏度,但不能鑒別結(jié)核感染是活動(dòng)性,陳舊性或潛伏性,因此在臨床上T-spot TB陰性排除結(jié)核病意義較大,本次研究中三個(gè)試驗(yàn)的特異性分別為78.79%(T-SPOT.TB),77.27%(TB-DOT)和75.76%(ASSURE TB),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T-spot TB陽(yáng)性時(shí)應(yīng)根據(jù)患者臨床癥狀,胸片及其他實(shí)驗(yàn)室檢查,如抗酸桿菌涂片、結(jié)核抗體、PPD、ESR等綜合考慮,最終判斷患者是否為活動(dòng)性肺結(jié)核。

綜上所述,T-SPOT.TB試驗(yàn)在結(jié)核感染診斷中顯示較高的敏感度和特異度,尤其在診斷菌陰肺結(jié)核患者中,其靈敏度優(yōu)于結(jié)核抗體,兩種方法聯(lián)合應(yīng)用對(duì)結(jié)核病血清學(xué)診斷具有輔助診斷價(jià)值。