隋小芳,徐 男,黃佳濱,費(fèi)秀斌,陳尚君,王鳳玲*

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年病科；2.佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯154002)

高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是由于同型半胱氨酸代謝相關(guān)的酶功能障礙引起的，血漿同型半胱氨酸水平大于或等于15.0 μmol/L被稱(chēng)作高同型半胱氨酸血癥[1]。Hcy升高的常見(jiàn)原因有遺傳、體內(nèi)葉酸、維生素B6、B12缺乏、慢性腎功能不全及生活方式等因素[2]，但在發(fā)展中國(guó)家，有關(guān)該基因的遺傳數(shù)據(jù)結(jié)果仍有爭(zhēng)議，需進(jìn)一步探討。

亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是由MTFHR基因編碼的，MTHFR催化5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸，是Hcy轉(zhuǎn)化為蛋氨酸的必要條件,是蛋氨酸循環(huán)通路的關(guān)鍵酶[3,4]。HHcy最常見(jiàn)的遺傳原因可能是C677T中C到T和A1298C中A到C的轉(zhuǎn)換[5]。但是在MTHFR(C677T和A1298C)中，突變的頻率和酶的活性受不同的種族和地理位置的影響，存在一定的差異[6,7]。

綜上，本研究旨在通過(guò)隨機(jī)招募長(zhǎng)期居住在佳木斯城區(qū)且沒(méi)有血緣關(guān)系的漢族中、老年人，經(jīng)病例對(duì)照設(shè)計(jì)研究，探討中國(guó)東北人群血漿同型半胱氨酸水平與MTHFR基因變異的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究總共隨機(jī)納入466例受試者，均為長(zhǎng)期居住在我國(guó)東北，佳木斯城區(qū)且沒(méi)有血緣關(guān)系的漢族人群；平均年齡(63.11±8.53)歲，男性231名。受試者在2016年10月至2017年3月經(jīng)佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院招募進(jìn)入臨床檢查并分組，高同型半胱氨酸血癥組(HHcy組)有206例、正常同型半胱氨酸血癥組(Hcy組)有260例受試者。

高同型半胱氨酸血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)：Hcy≧15 μmol/L[1]。所有受試者排除肝功能不全、腎功能不全、和惡性疾病患者，以及排除一些潛在的混雜因素。本研究已經(jīng)通過(guò)佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的認(rèn)可，且已經(jīng)獲得所有研究對(duì)象的知情同意書(shū)，同意提供外周靜脈血做基因型檢測(cè)分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1同型半胱氨酸檢測(cè)

所有受試者空腹8 h后采集靜脈血5 ml于紫色抗凝真空采血管中，采用循環(huán)酶法測(cè)得受試者血漿同型半胱氨酸水平。

1.2.2基因型檢測(cè)

采集所有受試者靜脈血2 ml于紫色抗凝真空采血管中，放置-20℃冰箱中冷藏保存。DNA提取使用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法(酚氯仿方法)。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性對(duì)SNP進(jìn)行基因型分析，并用高分辨溶解曲線進(jìn)行基因型分析。為了保證基因分型的質(zhì)量，我們隨機(jī)選擇了3個(gè)基因型樣品進(jìn)行直接測(cè)序,未見(jiàn)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究中進(jìn)行的所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙尾，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)驗(yàn)證樣本的群體代表性；樣本均值的組間比較使用t檢驗(yàn)，分類(lèi)變量用頻數(shù)表示；運(yùn)用χ2檢驗(yàn)分析C677T突變、A1298C突變與受試者的一般臨床資料；通過(guò)SHEsis在線軟件分析比較HHcy組與Hcy組人群中基因組合(單倍型)的交互作用。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象臨床基線數(shù)據(jù)的比較

所有研究對(duì)象的臨床基線數(shù)據(jù)及其既往所患疾病的信息，見(jiàn)表1。兩組的男/女性別比較(143/63 vs.88/172，P<0.01),兩組的年齡比較(65.15±9.03 vs.62.37±8.20，P=0.04)，進(jìn)一步將年齡按照WHO年齡劃分標(biāo)準(zhǔn)分為：中青年(40-59 歲)、年輕老年人(60-69 歲)、老年人(>70 歲)的界限分組，分析結(jié)果仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在空腹血糖和膽固醇等臨床指標(biāo)無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表1 兩組研究對(duì)象在臨床基線數(shù)據(jù)的比較

注：M:男,F:女,Hcy:同型半胱氨酸TG:甘油三酯,TC:總膽固醇,LDL:低密度脂蛋白,HDL:高密度脂蛋白,T2DM:2型糖尿病,HTN:高血壓.*表示P<0.05.

2.2 MTHFR C677T和A1298C的基因型和等位基因頻率的單獨(dú)關(guān)聯(lián)分析

MTHFRC677T和A1298C基因中的基因型和等位基因頻率在HHcy組、Hcy組間的比較，見(jiàn)表2和表3。在C677T中與正常Hcy組比較，HHcy組TT基因型明顯增高(47.58% vs.21.92%，P<0.01)、T等位基因頻率明顯高于正常Hcy組(69.17% vs.50.58%，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在A1298C中，HHcy組CC基因型明顯低于正常Hcy組(1.94% vs.8.85%，P<0.01)、C等位基因頻率顯著低于正常Hcy組、A等位基因頻率高于正常Hcy組，分別為(19.90% vs.26.54%)、(80.10% vs.73.46%，P=0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 兩組MTHFR C677T基因多態(tài)性的基因型及等位基因頻率分布

注：OR:比值比，CI:置信區(qū)間；P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 兩組MTHFR A1298C基因多態(tài)性的基因型及等位基因頻率分布

注：P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 比較高同型半胱氨酸血癥攜帶者中基因組合(單倍型)的交互作用

將MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)的基因組合(單倍型)結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示：HHcy組與Hcy組比較時(shí)，C677T的C和A1298C的A存在正向交互作用[P=0.003，OR(CI)=0.634(0.469-0.859)<1]，C677T的C和A1298C的C存在正向交互作用[P<0.01,OR(CI)=0.440(0.298-0.648)<1]；C677T的T和A1298C的A存在正向交互作用[P<0.01,OR(CI)=1.842(1.418-2.394)>1]；C677T的T和A1298C的C無(wú)正向交互作用[P=0.055,OR(CI)=1.586(0.988-2.546)>1]，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)的基因組合(單倍型)與HHcy組和Hcy組之間的比較

注：@基因單倍型的多態(tài)性順序：C677T和A1298C，通過(guò)使用SHEsis在線分析軟件測(cè)得χ2和P值。

3 討論

高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是基因和遺傳因素共同調(diào)控的結(jié)果[8]。MTHFR C677T基因多態(tài)性中C等位基因到T等位基因的替換過(guò)程中，MTHFR酶活性分別降低了70%和35%左右，進(jìn)而Hcy水平增高[9,10]。在A1298C基因位點(diǎn)中，Zappacosta1等人的研究結(jié)果表明AA基因型的人群Hcy普遍高于CC型，Jadeja等人研究表明A1298C基因多態(tài)性與HHcy明顯相關(guān)[11,12]。在本次研究結(jié)果顯示A1298C基因多態(tài)性中攜帶AA基因型的人群數(shù)量普遍高于CC型，并且1298A可能與HHcy相關(guān)，研究結(jié)果與前人相同。在兩位點(diǎn)(C677T和A1298C)的交互作用分析中，C677T的C和A1298C的A、C677T的C和A1298C的C的交互作用，可能是高同型半胱氨酸血癥的保護(hù)因素，而C677T的T和A1298C的A交互作用，可能是高同型半胱氨酸血癥的致病因素。但未來(lái)需要擴(kuò)大樣本量深入研究。

綜上所述，本研究表明高同型半胱氨酸水平與MTHFR 677T和1298A基因變異有關(guān)。