楊春梅，喬光磊，宋麗娜，吳偉琪，陳 穎，夏 薇，馬俐君*

(1.北華大學(xué)，吉林 吉林132013；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院 腫瘤科，上海200336)

原發(fā)性肝癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，目前在全世界癌癥發(fā)病率中占第六位，死亡率占第四位，其中肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是其主要病理類(lèi)型(占75%-85%)[1]。目前原發(fā)性肝癌最有效的治療方法仍然是手術(shù)治療，但由于早期癥狀并不明顯，大部分患者確診時(shí)已是中晚期，僅有約30%的患者適于根治性切除術(shù)[2]，導(dǎo)致生存率低、預(yù)后差。血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotien，AFP)是目前早期診斷原發(fā)性肝癌的首選腫瘤標(biāo)志物，但其特異性與敏感性不強(qiáng)限制了其臨床價(jià)值[3]。因此，尋找更加有效的腫瘤標(biāo)志物是原發(fā)性肝癌早期診斷、早期治療及改善預(yù)后的關(guān)鍵所在。

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類(lèi)具有穩(wěn)定閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、表達(dá)豐度高和組織特異性表達(dá)等特征[4,5]。近年的研究表明，circRNA的主要功能包括miRNA“海綿”[6]、調(diào)控親本基因表達(dá)[7]、影響基因轉(zhuǎn)錄水平[8]等，并且與多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[9-11]。由于circRNA的特殊結(jié)構(gòu)，可耐受核酸外切酶的降解，比線性RNA更加穩(wěn)定，并且廣泛存在于血液、腦脊液、尿液等體液中[12,13]，因此其可能作為腫瘤標(biāo)志物對(duì)惡性腫瘤的診斷及預(yù)后具有重要意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0003998顯著高表達(dá)于有門(mén)靜脈侵犯的HCC癌組織中，因此，本研究旨在檢測(cè)hsa_circ_0003998在HCC血漿中的表達(dá)水平，探討其在HCC診斷及預(yù)后評(píng)估的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與研究對(duì)象

1.1.1主要試劑

Trizol LS試劑(Invitrogen)，總RNA提取試劑盒(RNeasy Plus Mini Kit，QIAGEN),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)。

1.1.2研究對(duì)象

本研究收集2015年1月至2016年10月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院診治的行肝癌切除術(shù)且病理診斷為HCC的患者共80例，患者術(shù)前均未接受放化療，收集80例患者術(shù)前的空腹靜脈血，隨訪至2018年10月；同時(shí)期健康人群和乙型肝炎人群各20例，收集空腹靜脈血。本研究經(jīng)上海市同仁醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣本采集

采集研究對(duì)象空腹靜脈血，EDTA抗凝，4℃，1 600×g 離心10 min；12 000 g離心10 min后分離得到血漿，-80℃保存?zhèn)溆?。收?例HCC癌組織(有/無(wú)門(mén)靜脈侵犯者各3例)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2總RNA提取及cDNA合成

每250 μl血漿中加入750 μl Trizol LS試劑，進(jìn)行裂解，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA；剪取100 mg組織，至研磨皿中，倒入液氮，將組織研磨成粉末狀，放于EP管中，加入1 ml預(yù)冷的Trizol LS試劑，吹打均勻，室溫放置5 min，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA；使用NanoDrop ND-1000測(cè)定RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.3轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-sequening,RNA-seq)

RNA-seq由上海烈冰信息科技有限公司進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)要步驟如下：分別提取6例HCC癌組織的總RNA，使用RiboMinus真核細(xì)胞試劑盒去除核糖體RNA，使用核酸外切酶(Rnase R)去除線性RNA，根據(jù)NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep試劑盒使用HiSeq2000(Illumina，美國(guó))進(jìn)行測(cè)序工作。差異表達(dá)基因的篩選閾值：|log2FC|>1，且P值小于0.05。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR)

使用LightCycler 480II (Roche)儀器，采用SYBR法進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)步驟及反應(yīng)條件參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR引物由生工生物工程(上海)合成，hsa_circ_0003998上游引物為5’-CAGGAGGTGGTGAAGGACAT-3’，下游引物為5’-CCTGACTGTGCTTCAAACGA-3’，內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游引物為5’-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’，下游引物為5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’，反應(yīng)體系為為20 μl，SYBR Premix Ex Taq(2x)10 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA 0.5 μl，ROX 0.5 μl，dH2O 8.1 μl。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 5 min，95℃ 5 s，59℃ 10 s，72℃ 30 s，40循環(huán)，通過(guò)熔解曲線檢測(cè)產(chǎn)物的特異性，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均Ct值作為樣本最后Ct值，計(jì)算2-△△CT值反應(yīng)hsa_circ_0003998表達(dá)水平。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間比較采用方差分析；采用GraphPad Prism 5軟件繪制受試者工作特征曲線(Receiver operator characteristic curve,ROC)，并計(jì)算曲線下面積(Area under of ROC curve,AUC)評(píng)估血漿hsa_circ_0003998對(duì)HCC的診斷價(jià)值；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，log-rank法進(jìn)行單因素分析，檢驗(yàn)因素包括性別、年齡、乙肝表面抗原(HBsAg)、AFP、腫瘤直徑、TNM分期、腫瘤分化程度、微血管侵犯(MVI)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)及hsa_circ_0003998相對(duì)表達(dá)量，COX回歸分析進(jìn)行多因素分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0003998在有門(mén)靜脈侵犯的HCC癌組織中高表達(dá)

RNA-seq檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在有/無(wú)門(mén)靜脈侵犯的HCC癌組織中有121個(gè)共同表達(dá)的circRNA，其中上調(diào)表達(dá)的有14個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有8個(gè)，上調(diào)表達(dá)最明顯的為hsa_circ_0003998。

2.2 不同分組血漿中hsa_circ_0003998的表達(dá)水平

利用qRT-PCR檢測(cè)HCC、乙型肝炎和健康人中hsa_circ_0003998表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)HCC血漿中hsa_circ_0003998表達(dá)水平顯著高于乙型肝炎組和健康人組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.12±1.97 vs 1.43±0.91，P<0.001;3.12±1.97 vs 1.21±1.08，P<0.001)，乙型肝炎組和健康人組hsa_circ_0003998的表達(dá)無(wú)明顯差異(P=0.678)(圖1)。

圖1 hsa_circ_0003998在原發(fā)性肝細(xì)胞癌、乙型肝炎及健康人血漿中表達(dá)水平

2.3 血漿hsa_circ_0003998表達(dá)水平與HCC臨床病理特征的相關(guān)性

HCC血漿中hsa_circ_0003998的高表達(dá)水平與AFP(P=0.012)、腫瘤直徑(P=0.007)、TNM分期(P=0.011)及組織分化程度(P=0.015)顯著相關(guān)，而與患者的年齡、性別、HBsAg、MVI、ALT、AST、γ-GT均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)(表1)。

表1 血漿hsa_circ_0003998表達(dá)水平與原發(fā)性肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4 血漿hsa_circ_0003998的診斷價(jià)值

為了評(píng)估血漿hsa_circ_0003998的診斷價(jià)值，繪制了HCC區(qū)別于健康人的ROC曲線，AUC為0.848，敏感度為75%，特異度為85%(圖2A)；繪制了HCC區(qū)別于乙型肝炎的ROC曲線，AUC為0.807，敏感度為70%，特異度為80%(圖2B)，表明hsa_circ_0003998具有較好的診斷HCC的臨床價(jià)值。

圖A為原發(fā)性肝細(xì)胞癌與健康人比較，圖B為原發(fā)性肝細(xì)胞癌與乙型肝炎比較

2.5 血漿hsa_circ_0003998的預(yù)后價(jià)值

根據(jù)HCC血漿hsa_circ_0003998的相對(duì)表達(dá)中位值(2-△△CT=2.5)分為高、低表達(dá)組，Kaplan-Meier分析顯示低表達(dá)組的總生存時(shí)間(overall survival,OS)顯著長(zhǎng)于高表達(dá)組(34.91±1.75 vs 27.26±1.82，P=0.002，圖3)。

2.6 預(yù)后單因素分析

單因素分析顯示，AFP(P=0.004)、TNM分期(P=0.013)和hsa_circ_0003998表達(dá)水平(P=0.003)為影響HCC預(yù)后的相關(guān)因素(表2)。

2.7 預(yù)后多因素分析

將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素引入多因素COX模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，hsa_circ_0003998表達(dá)水平(P=0.041)和AFP(P=0.039)是影響HCC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表2)。

圖3 hsa_circ_0003998表達(dá)水平與HCC患者OS的關(guān)系

表2 原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的單因素與多因素分析

圖4 預(yù)測(cè)hsa_circ_0003998的潛在靶標(biāo)miRNA

3 討論

原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，HCC是其主要病理類(lèi)型，具有惡性程度高、侵襲能力強(qiáng)、進(jìn)展迅速和預(yù)后差等特點(diǎn)，其死亡率在我國(guó)消化系統(tǒng)惡性腫瘤中位居第二位，僅次于胃癌[14]。早期根治性切除是目前治療原發(fā)性肝癌最有效的方法，因此早期診斷成為早期治療的關(guān)鍵。目前主要是通過(guò)血清AFP檢測(cè)聯(lián)合影像學(xué)檢查來(lái)進(jìn)行原發(fā)性肝癌的早期診斷，血清AFP是首選的原發(fā)性肝癌腫瘤標(biāo)志物，但存在一定的局限性，約有30%-40%的原發(fā)性肝癌患者的AFP檢測(cè)結(jié)果為陰性[15,16]，從而引起漏診；而在肝炎、肝硬化及胚胎性腫瘤患者的血清中AFP水平會(huì)增高，這些原因?qū)е翧FP無(wú)法成為早期篩查原發(fā)性肝癌的理想指標(biāo)[17]。

circRNA是一類(lèi)特殊的非編碼RNA分子，通過(guò)非線性反向剪接形成閉合狀結(jié)構(gòu)，其表達(dá)具有組織特異性和高度保守性等特點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄、翻譯等生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8,18]。近期研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可發(fā)揮miRNA“海綿”作用，解除miRNA對(duì)其靶基因的抑制[19]；可與RNA聚合酶II結(jié)合促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[20]；可充當(dāng)RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein,RBP)海綿，調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)的活性[21]，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[22,23]。某些特定的circRNA可在人血漿、唾液及其他體液中穩(wěn)定表達(dá)，為其作為疾病診斷標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)，如Huang等[24]發(fā)現(xiàn)胃癌患者血漿中hsa_circ_0000745的表達(dá)水平顯著低于健康人，其聯(lián)合CEA檢測(cè)有較好的早期診斷價(jià)值，可作為胃癌早期診斷的一種潛在分子標(biāo)志物。

本研究中，我們通過(guò)RNA-seq發(fā)現(xiàn)了顯著高表達(dá)于有門(mén)靜脈侵犯的HCC癌組織的circRNA—hsa_circ_0003998，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HCC血漿hsa_circ_0003998的表達(dá)水平顯著高于乙型肝炎和健康人，并且hsa_circ_0003998表達(dá)水平與患者的AFP、腫瘤直徑、TNM分期及組織分化程度顯著相關(guān)，hsa_circ_0003998高表達(dá)的患者，其AFP較高、腫瘤直徑較大、TNM分期較晚及組織分化程度較低，表明hsa_circ_0003998可能與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

進(jìn)一步對(duì)hsa_circ_0003998作為HCC潛在的診斷及預(yù)后分子標(biāo)志物進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示血漿hsa_circ_0003998在用于區(qū)別HCC與乙型肝炎及健康人時(shí)，具有較好的診斷價(jià)值，可作為一種新的潛在的原發(fā)性肝癌腫瘤標(biāo)志物繼續(xù)研究探索。通過(guò)預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，血漿hsa_circ_0003998高表達(dá)患者的總生存時(shí)間顯著短于低表達(dá)患者，并且hsa_circ_0003998和AFP是影響HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。由此提示，hsa_circ_0003998可作為HCC診斷和預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)志物。

經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)可知，miR-326、miR-330和miR-636可能是hsa_circ_0003998的潛在靶標(biāo)(圖4)。Yu W等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中hsa_circ_0003998通過(guò)miRNA“海綿”作用吸附miR-326，從而調(diào)控Notch1基因的表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲。因此miR-326可能作為hsa_circ_0003998在HCC中的潛在靶標(biāo)進(jìn)行后續(xù)研究。

綜上所述，hsa_circ_0003998可能作為一種新的生物學(xué)標(biāo)志物用于HCC患者的早期診斷和預(yù)后評(píng)估。