馮漢宇 張秀海 陳傳永 張殿朋

摘? 要：玉米自交系京501和京24屬于不同基因型，京501與京24雜交F2代通過3代自交得到F5代株系，PCR檢測(cè)A-45（11-1）、A-44（10-7）、京24等株系葉片，發(fā)現(xiàn)它們含有P1轉(zhuǎn)錄因子，液相色譜分析A-45（11-1）、A-44（10-7）、A-37（12-5）、京24等株系籽粒果皮發(fā)現(xiàn)，果皮中含有鞣酐，而且它們的果皮表現(xiàn)出不同類型的紅色，紙層析和顯微觀察發(fā)現(xiàn)果皮組分含有蛋白質(zhì)和磚紅色物質(zhì)，所以F5代株系果皮P1轉(zhuǎn)錄因子可能來自京24。

關(guān)鍵詞：果皮;鞣酐;轉(zhuǎn)錄因子;玉米

中圖分類號(hào) S513文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）08-0009-05

Abstract：Maize inbred lines Jing501 and Jing24 are belonging to different genotypes，F(xiàn)5 generations lines containing transcription factor P1 were generated by three selfing cross pollination of Jing 501*Jing24 hybrid F2 generations，PCR assays of gene P1 and analysis of phlobaphene were conducted by HPLC. PCR analysis showed that the P1 transcription facteor was in maize genome of A-45，A-44 and Jing24;HPLC analysis of A-45（11-1），A-44（10-7），A-37（12-5）and Jing24 lines pericarps revealed that the accumulation of red phlobaphene in pericarps. moreover their pericarp appeared different type red color ，we found that pericarp components contains protain and brick red material by microscope observed and paper separate out，These results suggest that the P1transcription factor of F5 generations maybe come from Jing 24.

Key words：Pericarp;Phlobaphene;Transcription factor;Maize

花青素能在玉米植株大多數(shù)器官中積累，然而鞣酐只是在籽粒果皮、穗穎和雄穗中發(fā)現(xiàn)[1]，花青素和鞣酐的積累方式不同，花青素在植株發(fā)育的整個(gè)生育期的營(yíng)養(yǎng)和花器官組織中都能發(fā)現(xiàn)[2]，鞣酐僅在玉米植株發(fā)育的后期出現(xiàn)。編碼并調(diào)解花青素和鞣酐的轉(zhuǎn)錄因子不同，Tuerck于1994年研究認(rèn)為調(diào)節(jié)磚紅色鞣酐合成的轉(zhuǎn)錄因子是P1。P1屬于R2R3-MYB調(diào)節(jié)基因家族[3]，編碼序列專一性的DNA結(jié)合蛋白，具有轉(zhuǎn)錄因子功能[4]，調(diào)節(jié)磚紅色鞣酐生物合成。研究表明，P1在籽粒果皮、花絲和穗穎中表達(dá)[5]，能觀察到的P1最明顯的表型在籽粒果皮和成熟玉米穗的穗穎中[6]。

本次實(shí)驗(yàn)主要研究鞣酐生物合成及P1基因的遺傳來源，我們選育一些籽粒果皮含有鞣酐且基因組含有參與鞣酐合成的P1轉(zhuǎn)錄因子的株系[7]，給出基因和組化的數(shù)據(jù)支持我們的試驗(yàn)結(jié)果，即籽粒果皮顏色的變化來自于P1轉(zhuǎn)錄因子參與并調(diào)節(jié)的鞣酐片層的累積。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 玉米自交系京501、京24，由陳剛研究員選育;F5代株系材料由京501與京24雜交2代經(jīng)過幾代套袋自交授粉得到，編號(hào)分別為A-45（11-1）、A-37（12-5）、A-44（10-7）、B-14（9-2）、A-47（11-4）、A-40-3（9-5）;京24種子，由北京農(nóng)科院種業(yè)公司陳傳永提供。

1.2 不同材料的穗基因型和表型 P基因及等位基因的鑒別依靠它們?cè)诠ず退敕f中的表達(dá)，P1-rr定義為紅果皮紅穗軸，P1-wr為是白果皮紅穗軸，P1-rw為紅果皮白穗軸，P1-ww是白果皮白穗軸[8]，在試驗(yàn)中采用標(biāo)準(zhǔn)的玉米遺傳基因分類法[9]，P1基因的鑒別依靠PCR檢測(cè)葉片和果皮及穗穎色，京24白色果皮，有些有紅色斑點(diǎn)，紅穗穎，F(xiàn)5代株系A(chǔ)-37（12-5）、A-47（11-4）和A-45（11-1）紅果皮和紅穗穎，A-44（10-7）和A-40-3（9-5）株系有紅色斑點(diǎn)果皮，白穗穎，B-14（9-2）株系淡紅果皮紅穗穎（表1）。

1.3 果皮成分紙層析與組化染色 取20粒種子，用清水浸泡1h，去掉黑層，剝下果皮陰干后，加幾粒石英砂研磨粉碎，然后加4mL蒸溜水，室溫提取30min。用層析濾紙吸取上清液，用pH值為4.5的95%的酸性乙醇染色，陰干后用pH值為2的one step blue染色，用pH值為2的酸性考馬斯亮藍(lán)R250染色。用吸管吸取上清液滴3滴在載玻片上，用pH值為2的one step blue 染色，用pH值為2的酸性考馬斯亮藍(lán)R250染色。從研磨樣中取一些碎薄片，用pH值為2的酸性one step blue 染色，用pH為2的酸性考馬斯亮藍(lán)R250染色，200倍顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 果皮成分提取與液相色譜分析 把種子從穗上剝離，取一些籽粒用清水浸泡1h，去掉黑層，剝下果皮晾干并拍照，用研磨儀磨碎，用生物中心的液相色譜檢測(cè)，1mL冰乙酸溶于500mL純凈水中，pH值3.523，稱取0.4g左右的果皮粉碎樣，加入5mL提取液（1mL冰醋酸加入500mL水），50℃水浴0.5h，10000轉(zhuǎn)/s離心5min，取上清2mL，陰干至0.5～1mL，過0.22μm膜。用Agilent1100型高效液相色譜儀紫外檢測(cè)器檢測(cè);流動(dòng)相乙腈和水為60∶40，柱溫：室溫30℃，流速0.8mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)515nm，進(jìn)樣量20μL，上次用乙醇提取的樣品，在室溫條件下陰干，加入0.8mL冰乙酸水溶液用于測(cè)定，提取時(shí)發(fā)現(xiàn)有些樣品存在溶解不完全現(xiàn)象，參照周波方法并更改（2008）[10]。樣品編號(hào)分別為A-45（11-1）、A-37（12-5）、A-44（10-7）、B-14（9-2）、A-47（11-4）、A-40-3（9-5）和京24。

1.5 抽樣PCR檢測(cè)4個(gè)株系的P1mRNA表達(dá) 北京億鳴復(fù)興生物科技有限公司qPCR實(shí)驗(yàn)報(bào)告檢測(cè)4個(gè)株系9-5（A-40-3）、10-7（A-44）、11-1（A-45）和京24葉片或幼苗中P1mRNA的表達(dá)情況?；騊1引物F：GGAGGAAGAAGACATCATCATCATCAA，R：AGCCAGCACAGCACACACACTG。基因Actin引物F：TCCGCATCTACATCTATACGCTC，R：AGGTCACAGGAGTAGAGTTGCTTT，使用 Genstar-TRIGene總RNA提取試劑按照kit說明提取RNA。反轉(zhuǎn)錄，使用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser按照kit說明反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)液10.0μL，PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1.0μL，lOligdT 1.0μL，5×PrimeScript Buffer 2 4.0μL，RNase Free dH2O 4.0μL，Total 10μL;反應(yīng)條件如下：37℃ 15 min，85℃ 5 sec，4℃保存。PCR體系配置（20μL體系）Taq DNA Polymerase（Mg2+ plus Buffer）0.5μL，PCR Forward Primer1.0μL，PCR Reverse Primer1.0μL，dNTP MIX 0.4μL，DNA模板2.0μL，dH2O（滅菌蒸餾水）13.1μL，Buffer2.0μL，Total 20.0μL，混合均勻，離心加入PCR板里。PCR反應(yīng)程序設(shè)置，溫度95℃變性3min，循環(huán)數(shù)1;72℃退火30s，循環(huán)數(shù)40，72℃延伸5min，循環(huán)數(shù)1，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，染色，凝膠成像儀上觀察拍照。

1.6 玉米P1蛋白分子量計(jì)算，亞細(xì)胞定位與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 玉米P1蛋白登錄號(hào)CAA77939，通過在線protparam軟件計(jì)算P1蛋白的氨基酸數(shù)，分子量，理論P(yáng)I，分子式，原子數(shù)等，并通過在線wolfpsort蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)在線軟件對(duì)P1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，通過在線軟件phyre2和swiss-mode預(yù)測(cè)玉米P1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 7個(gè)株系籽粒果皮顏色 剝離果皮以后，對(duì)不同株系籽粒果皮色進(jìn)行調(diào)查，表明不同株系籽粒果皮顏色存在差異。A-37（12-5）株系籽粒果皮血紅色，A-47（11-4）和A-45（11-1）株系籽粒果皮淡紅色，京24、A-44（10-7）和A-40-3（9-5）株系籽粒果皮白色，有些有紅色斑點(diǎn)，9-2（B-14）株系籽粒果皮紅色斑點(diǎn)顏色加深（圖1）。

2.2 果皮成分試紙檢測(cè) 通過紙層析，one step blue和考馬斯亮藍(lán)R250染色發(fā)現(xiàn)7個(gè)株系籽粒果皮提取物質(zhì)在紙上呈線條狀分部，考馬斯亮藍(lán)R250染色的12-5（A-37）、A-40-3（9-5）和A-45（11-1）株系籽粒果皮提取物質(zhì)在紙上分上下2層，上層為磚紅色鞣酐，下層是藍(lán)綠色蛋白質(zhì)，one step blue 染色的A-37（12-5）株系籽粒果皮提取物質(zhì)在紙上分3個(gè)部分，上層是磚紅色鞣酐，最下層可能是one step blue染色物質(zhì)，中間零星分布一些藍(lán)綠色蛋白質(zhì)，B-14（9-2）株系籽粒果皮提取物質(zhì)也是如此，2種化學(xué)試劑染色的A-44（10-7）、京24株系籽粒果皮提取物質(zhì)上層鞣酐較少，顏色較淺，one step blue 染色的沒能完全分離開。

2.3 6個(gè)株系籽粒果皮碎片染色顯微觀察 對(duì)A-37（12-5）、京24、A-45（11-1）、A-44（10-7）、B-14（9-2）和A-40-3（9-5）6個(gè)株系籽粒果皮采用兩種化學(xué)試劑染色并顯微觀察發(fā)現(xiàn)，6個(gè)株系籽粒果皮one step bue 染色以后，都有一些藍(lán)色蛋白分布其中，也有一些呈凝膠狀或粉狀磚紅色物質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)R250染色以后，僅能發(fā)現(xiàn)一些凝膠狀或粉狀的磚紅色物質(zhì)，其它為藍(lán)色物質(zhì)，不染色的對(duì)照里面僅能發(fā)現(xiàn)一些磚紅色物質(zhì)，其中A-37（12-5）株系籽粒果皮磚紅色物質(zhì)最多。

2.4 4個(gè)株系P1m RNAPCR檢測(cè) 為了解P1基因在一些株系中表達(dá)情況，選出3個(gè)株系葉片進(jìn)行mRNA的PCR檢測(cè)，比如A-44（10-7）、A-40-3（9-5）和A-45（11-1），PCR檢測(cè)結(jié)果表明P1基因在這3個(gè)株系基因組里并且有表達(dá)。同時(shí)，為了驗(yàn)證這些株系的P1基因來自京24自交系，對(duì)京24自交系進(jìn)行了2次P1基因mRNA的PCR檢測(cè)，第1次僅在幼苗中檢測(cè)到了P1基因有表達(dá)，葉片中沒有檢測(cè)到，第2次幼苗和葉片中都檢測(cè)到了P1基因有表達(dá)（圖2）。

2.5 P1蛋白氨基酸序列分析、定位與結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè) 從文獻(xiàn)[13]中取得P蛋白序列和部分基因序列，玉米P蛋白登錄號(hào)CAA77939，通過在線protparam軟件預(yù)測(cè)氨基酸數(shù)399，分子量43756.34，理論P(yáng)110.16，分子式C1879H3029N607O575S15，原子數(shù)6102，N端為MET，通過在線wolfpsort蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明玉米P1蛋白最有可能定位在細(xì)胞核中。在P1蛋白氨基酸組分中，Arg、Ser含量最多，為10%以上，Phe、Met和Tyr含量較少，為1%左右，Pyl和Sec含量幾乎沒有（見表2）。通過在線軟件phyre2和SWISS-MODE預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，P1蛋白模型的氨基端氨基酸序列與以前文獻(xiàn)的也不完全一樣，預(yù)測(cè)的最終P1蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域模型氨基端序列可能從13號(hào)氨基酸到210號(hào)氨基酸（圖3）。

2.6 7個(gè)株系籽粒果皮成分液相色譜檢測(cè) 為了驗(yàn)證籽粒果皮顏色的變化是由鞣酐含量的變化引起的，我們對(duì)7個(gè)株系籽粒果皮進(jìn)行了液相色譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些株系籽粒果皮都含有且主要含有一種成分鞣酐，由于編碼MYB類轉(zhuǎn)錄因子的P1基因在果皮中響應(yīng)鞣酐累積，所以通過檢測(cè)這些玉米株系籽粒果皮也證實(shí)了這一點(diǎn)（圖4峰），即含轉(zhuǎn)錄因子P1基因的玉米株系能在果皮中積累鞣酐。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論 紅色鞣酐在果皮中合成只有一個(gè)前體物質(zhì)黃烷4醇[12]，鞣酐的產(chǎn)生需要P1調(diào)節(jié)基因，ZmF3'H編碼黃烷酮-3羥化酶參與了鞣酐的生物合成，在玉米中它是P蛋白的直接目標(biāo)[13]，Grotewold在1994年[14]研究認(rèn)為，通過選育P1調(diào)節(jié)基因能夠得到果皮中富含鞣酐的種子，P1蛋白是myb類蛋白，識(shí)別序列CCT/AACC，有的文獻(xiàn)報(bào)道A1啟動(dòng)子需要P1蛋白的轉(zhuǎn)錄活化，P1蛋白氨基端結(jié)合A1基因啟動(dòng)子重疊序列ACCT/AACC即-65～-54區(qū)域，轉(zhuǎn)錄激活A(yù)1啟動(dòng)子-123～-109區(qū)域使A1基因轉(zhuǎn)錄生成二氫黃酮醇還原酶[15-16]。本試驗(yàn)用F5代株系中P1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因可能來自果皮帶有紅色斑點(diǎn)的京24，PCR檢測(cè)到了A-45（11-1）、A-44（10-7）、A-40-3（9-5）和京24株系的P1基因的mRNA表達(dá)，液相色譜分析了A-37（12-5）、A-45（11-1）、京24、A-47（11-4）A-40-3（9-5）和B-14（9-2）株系籽粒果皮表明果皮中有鞣酐存在。在本次試驗(yàn)研究中，觀察到A-45（11-1）和A-37（12-5）株系籽粒果皮鞣酐累積增加了，果皮紅色加深，所以P1基因?qū)ぶ绪肤锖铣删哂兄匾{(diào)節(jié)作用。京24是白色果皮帶紅色斑點(diǎn)，紅色鞣酐在果皮有少量累積，沒有其他株系的多，可能合成路徑不同或基因序列不同，也可能與側(cè)翼區(qū)甲基化[17]，降低轉(zhuǎn)錄且抑制表達(dá)[18]，或象有的基因型一樣干擾穩(wěn)定的組織專一性鞣酐合成基因的表達(dá)有關(guān)[19]。

3.2 結(jié)論 由本次研究可知，通過雜交選育得到了一些籽粒果皮顏色不同的株系，有的株系籽粒果皮紅色加深，鞣酐含量提高。研究初步揭示了果皮色改變的調(diào)節(jié)機(jī)制，F(xiàn)5代株系中的P1調(diào)節(jié)基因來自京24玉米自交系，玉米P1蛋白表現(xiàn)出組織專一性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對(duì)于闡明不同玉米基因型籽粒果皮鞣酐生物合成具有重要意義。

參文文獻(xiàn)

[1]Coe，E.H.，Neuffer，M.G.，Hoisington，D.A..The genetics of corn. in corn and corn improvement[M].edited by Sprague GF，Dudley，JW. Madison：american society of agronomy，crop science society of america and soil science society of america，1988.

[2]Sidorenko，L.，Li，X. G.，Tagliani，L.，et al.Characterization of the regulatory elements of the maize P-rr gene by transient expression assays[J].Plant Molecular Biology，1999，39：11-19.

[3]Grotewold，E.，Sainz ，M.B.，Tagliani，L. Identification of the residues in the Myb domain of maize C1 that specify the interaction with the bHLH cofactor R[J].Proc Natl Acad Sci.，2000，97（25）：13579-13584.

[4]Saikumar，P.，Ramachandran，M.E，. Premkumar Reddy. Role of tryptophan repeats and flanking amino acids in Myb-DNA interactions[J].Proc. Natl. Acad. Sci.，1990，87：8452-8456.

[5]Zhang，P. f.，Wang，Y. b.，Zhang，J，b.，et al A maize QTL for silk maysin levels contains duplicated Myb-homologous genes which jointly regulate flavone biosynthesis[J].Plant Molecular Biology，2003，52：1-15.

[6]Boddu，J.，Jiang，C.，Sangar，V.，et al.. Comparative structural and functional characterization of sorghum and maize duplications containing orthologous Myb transcription regulators of 3-deoxyflavonoid biosynthesis[J].Plant Molecular Biology，2006，60：185-199.

[7]Feng H Y，Wei J H，Wang X M，et al. Inquiry of different color kernel seeding development and anthocyanin accumulation base on slice technoligy[J].Seed technology ，2019（01）：94-96.

[8] Athma，P.，Grotewold，E.，Peterson，T.，Insertional mutagenesis of the maize P gene by intragenic transposition of Ac[J].Genetics，1992，13（1）：199-209.

[9]Polacco，M. Maize genetic nomenclature guide. In TIG genetic nomenclature guide[M].edition. Edited by Wood R.Amsterdam：Elsevier Science，1998.

[10]Zhou B.，Li X. H.，Wang X. H.，et al.Identification of main compositions in maize purple plant pigment[J].Nat Prod Res Dev.，2008，20：842-845.

[11]Grotewold E，Athma P，Peterson T. Alternatively spliced products of the maize P gene encode proteins with homology to the DNA-binding domain of myb-like transcription factors[J].Proc Natl Acad Sci USA，1991，88：4587-4591.

[12]Morohashi，K.，Casas，M. I.，F(xiàn)erreyra，L. F.，et al.A Genome-wide regulatory framework identifies maize pericarp color1 controlled genes[J].The Plant Cell，2012，24：2745–2764.

[13]Sharma，M，Chai，C.，Morohashi K，. Expression of flavonoid 30-hydroxylase is controlled by P1，the regulator of 3-deoxyflavonoid biosynthesis in maize[J].BMC Plant Biol，2012，12：196.

[14]Grotewold，E.，Drummond，B.J.，Bowen，B..The myb-homologous P gene controls phlobaphene pigmentation in maize floral organs by directly activating a flavonoid biosynthetic gene subse[J].Cell.，1994，76（3）：543-553.

[15]Tuerck，J. A.，F(xiàn)romm，M. E.Elements of the maize A1 promoter required for transactivation by the anthocyanin BI CI or phlobaphene P regulatory genes[J].The Plant Cell，1994，6：1655-1663.

[16]Sainz MB，Grotewold E，Chandler VL：Evidence for direct activation of an anthocyanin promoter by the maize C1 protein and comparison of DNA binding by related Myb domain proteins[J].Plant Cell，1997，9（4）：611-625.

[17]Sidorenko，L.V.，Peterson，T.，Transgene-induced silencing identifies sequences involved in the establishment of paramutation of the Maize p1Gene[J].The Plant Cell，2001，13：319-335.

[18]Goettel，W.，Messing，J.，.Paramutaenicity of a p1 epiallele in maize[J] Theor Appl Genet. 2013，.12（6）：159-177.

[19]Robbins M L，Wang P H，Sekhon R S. et al.Gene structure induced epigenetic modifications of pericarp color1 alleles of maize result in tissue-specific mosaicism[J].Plos One，2009，4（12）：1-12. （責(zé)編：張宏民）