劉品彥 劉茹鳳 叢江珊 劉 春

(1.家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，重慶 400716)

家蠶是重要的經(jīng)濟昆蟲，又是遺傳學(xué)研究的良好材料。早在5000年前，人們就開始馴養(yǎng)家蠶。如果從1906年由日本遺傳學(xué)家外山龜太郎開展蠶絲性狀及形態(tài)突變的研究算起，至今家蠶遺傳學(xué)研究歷史已逾100年，并取得了豐碩的成果。全世界保存了大約1000種左右的突變體，其中西南大學(xué)家蠶基因資源庫保存了約有600份突變體。28個連鎖群現(xiàn)已全部發(fā)現(xiàn)，到2005年發(fā)表最新的經(jīng)典遺傳圖譜上共有246個形態(tài)和生化標(biāo)記，其中有196個已經(jīng)被定位在每個連鎖群上具體的座位上[1]，其它的分子圖譜也在20世紀(jì)90年代紛紛完成[2-5]。特別是到了21世紀(jì)，BAC文庫、EST文庫、家蠶基因組計劃、SNP連鎖圖譜相繼實施及完成[6-11]，為利用定位克隆的手段開展家蠶突變體分子遺傳研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。從2008年3月報道的第一個利用定位克隆闡明無翅(fl)突變機理[12]到現(xiàn)在，已經(jīng)有包括nsd-2、ow、od、bts、C、sch、mln、cts等突變種通過定位克隆的手段闡明了突變的分子機理[13-21]。

狹胸(narrowbreast,nb)突變種屬家蠶的自然突變，最早于1953年由日本學(xué)者筑紫發(fā)現(xiàn)，該突變?yōu)殡[性突變，幼蟲胸部狹窄，腹部肥大，近紡錐形，手觸松弛。該突變位于家蠶經(jīng)典遺傳連鎖圖中第19連鎖群19-31.2座位上，該連鎖群上還有Pes(19-0.0)、Gl(19-19.2)、Ict-D(19-29.1)、Alb(19-37.4)、msn(19-45.8)5個已定位標(biāo)記和4個未定位標(biāo)記。該突變是少數(shù)幾個關(guān)于家蠶形體的突變體，但其突變基因還未被分離克隆，其突變機理未知。為此，本研究首先對其突變性狀進(jìn)行了觀察，并利用SNP標(biāo)記對突變基因進(jìn)行了精細(xì)定位，為分離和克隆突變基因奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗選取西南大學(xué)家蠶基因庫系統(tǒng)編號為18-110的nb突變種及大造作為材料，常規(guī)桑葉飼育。以nb及大造作為親本，F(xiàn)1雄個體與nb雌個體回交后，根據(jù)突變表型對BC1代回交群體進(jìn)行單個樣品收集，液氮速凍后提取基因組DNA進(jìn)行連鎖分析。

1.2 外部形態(tài)及內(nèi)部器官觀察

分別選取健康而且大小適中5齡第3d和5齡第7d的nb/nb，nb/+進(jìn)行觀察拍照。取健康而且大小適中5齡5d家蠶大造和nb，從背部解剖，保持消化道的整體完整性，對位于胸部的消化道進(jìn)行形態(tài)觀察拍照。

1.3 基因組的提取

本實驗中使用的親本P代及F1代基因組利用DNAzol試劑(Roche公司)提取，回交群體基因組利用高通量的核酸自動抽提儀(Kurobo-PI1200，日本)進(jìn)行提取。操作方法按試劑盒說明書和儀器說明書進(jìn)行。提取的基因組DNA利用家蠶看家基因rpl3進(jìn)行PCR擴增，檢測基因組質(zhì)量。在抽檢的樣品中其出帶的比例達(dá)95%以上表明基因組DNA質(zhì)量可用于后續(xù)工作。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性10 sec，55℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，30個循環(huán)，72℃ 7 min，4℃保存。

1.4 SNP標(biāo)記引物及SNP位點鑒定

本實驗主要利用SNP標(biāo)記對nb突變基因進(jìn)行精細(xì)定位，其SNP標(biāo)記的引物序列主要根據(jù)Yamamoto[10]等人2008年公布的家蠶SNP圖譜中引物信息。利用親本基因組DNA 作為模板進(jìn)行PCR擴增，電泳檢測后進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序，其測序方法如下：首先使用SAP酶(TaKaRa公司)及Exonuclease I對PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，反應(yīng)條件：37℃ 20 min，80℃ 30 min。然后進(jìn)行測序PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：96℃ 1 min， 96℃ 10 sec，50℃ 5 sec，60℃ 4 min，25個循環(huán)，4℃保溫。最后使用乙醇醋酸鈉沉淀法對測序樣品進(jìn)行純化。使用HITACHI3730測序儀進(jìn)行測序分析。

表1 SNP標(biāo)記引物

續(xù)表1 SNP標(biāo)記引物

1.5 擴增產(chǎn)物的SNP位點查找

1.6 連鎖分析

在構(gòu)建連鎖圖譜時，把nb表型的個體標(biāo)記為A，正常表型的個體標(biāo)記為H，親本大造在SNP位點表型標(biāo)記為B，親本nb在SNP位點的表型標(biāo)記為A，F(xiàn)1在SNP位點的雜合型標(biāo)記為H，后面BC1的SNP位點表型也根據(jù)以上方法進(jìn)行標(biāo)記，統(tǒng)計結(jié)果整理放入Excel表格。

2 實驗結(jié)果及分析

2.1 nb突變體表型觀察

對不同發(fā)育時期的nb表型進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在幼蟲期的3齡末期即可從外觀體型上區(qū)分nb突變種和正常個體(nb/+)，從4眠開始正常個體和nb突變種間的體型差異開始明顯，到5齡后期，nb突變種表型明顯，胸部與身體的比例變小，胸部縮小，腹部膨大，導(dǎo)致nb突變種的整體呈紡錘體形，這種明顯的體型差異一直持續(xù)到蛹期(圖1)。對其體長和體重進(jìn)行測定，表明體重基本沒有差別，但是nb的體長短于正常個體。

圖1 nb/+和nb/nb基因型幼蟲期及蛹期的身體形態(tài)觀察

2.2 前腸形態(tài)觀察

因nb的表型差異主要出現(xiàn)在胸部，該區(qū)域主要包含較大的消化器官。為了觀察該區(qū)域的消化器官是否有異常，因此，本實驗對5齡5d正常食桑的正常表現(xiàn)及突變表型的回交個體進(jìn)行解剖觀察。結(jié)果表明，正常個體的前腸部分在食道區(qū)域充滿了桑葉碎片，與后面的中腸連接呈現(xiàn)漏斗狀，其形態(tài)是逐漸增大的過程。而在突變表型個體中，食道處未被桑葉碎片充盈且收縮，后面直接與膨大的中腸相連接 (圖2)，這可能是引起nb胸部狹小的形態(tài)原因。

圖2 nb和大造食道比較

2.3 低密度連鎖圖譜的構(gòu)建

雖然在形態(tài)上已經(jīng)看到了差異，但nb突變基因卻未知，為此，本實驗利用定位克隆方法對nb突變基因進(jìn)行了連鎖定位。本研究利用大造和nb為親本構(gòu)建BC1群體用于開展定位克隆，設(shè)計了27對引物用于初定位，其中包括21對SNP引物和6對SSR引物。經(jīng)過篩選，我們獲得了可用于定位的標(biāo)記10個。利用這些標(biāo)記和92個BC1代個體構(gòu)建了低密度連鎖圖譜，該圖譜包含40個交換個體。通過分析，我們把nb鎖定在標(biāo)記3和8之間，這兩個標(biāo)記的遺傳距離為7.8cM，物理距離約為1.7Mb。

2.4 高密度連鎖圖譜的構(gòu)建

然后，我們利用初定位標(biāo)記3和8從1794個BC1代個體中篩選得到67個交換個體。隨后，我們新設(shè)計了15對用于精細(xì)定位的SNP引物，經(jīng)過篩選，獲得了13個可用于定位標(biāo)記。利用9個標(biāo)記和67個交換個體構(gòu)建了高密度連鎖圖譜，該圖譜包含了8個標(biāo)記，54個交換個體。通過分析，我們把nb鎖定在標(biāo)記31和38之間區(qū)域，該區(qū)域物理距離約為1Mb(圖3)。通過對定位區(qū)域進(jìn)行基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)含有44個基因。結(jié)合低密度連鎖圖譜及高密度連鎖圖譜，繪制nb的定位連鎖示意圖(圖4)。

3 討論

nb突變體是家蠶少數(shù)的體型突變體之一，由于其突變基因未被分離克隆，其突變機理未知。本研究為了揭示其突變機理，本研究首先對其突變形態(tài)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)nb在食道處與正常相比存在差異；對其進(jìn)行定位克隆，將其突變基因鎖定在1Mb的范圍內(nèi)，該研究為nb突變基因的分離克隆奠定了基礎(chǔ)。

圖4 nb定位連鎖示意圖

本研究的一個新的發(fā)現(xiàn)是nb的前腸部分與正常相比有差異，推測該形態(tài)變化是導(dǎo)致其表型出現(xiàn)胸部狹小的主要原因。由于家蠶的體型主要受外骨骼及內(nèi)部器官的形態(tài)而決定，nb蠶與正常相比表現(xiàn)為胸部狹小，腹部膨大。對其胸部的前腸器官進(jìn)行解剖觀察，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域在nb中，其前腸在食道處縊縮，與其緊密連接的中腸迅速膨大。正常表型個體只在咽喉部縊縮，在食道處呈現(xiàn)漏斗狀的膨大形狀。我們推測，這樣的前腸形態(tài)導(dǎo)致nb的梭形體型。由于前腸壁有大量的肌肉組織，是否這些肌肉組織發(fā)育異常導(dǎo)致其形態(tài)的變化特征還有待進(jìn)一步研究。

同時，本研究以大造和nb為親本配置BC1代定位群體。利用92個BC1代個體和10個標(biāo)記構(gòu)建了低密度連鎖圖譜，把nb相關(guān)基因鎖定在1.7Mb的區(qū)域內(nèi)。進(jìn)一步利用1794個BC1代個體和8個標(biāo)記構(gòu)建了高密度連鎖圖譜，把nb相關(guān)基因鎖定在1Mb的區(qū)域內(nèi)。對定位區(qū)域進(jìn)行基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)含有44個基因。初步的基因注釋分析發(fā)現(xiàn)，在這些預(yù)測基因中，有11個表皮基因，其中一個編號為BGIBMGA001945含有Tsg結(jié)構(gòu)功能域，該基因和果蠅的cv基因具有很高的相似性。cv基因具有調(diào)控果蠅成蟲跳躍肌(TDT)肌纖維數(shù)量的功能[22-24]，在后期的研究中，該基因?qū)⒆鳛閚b的主要候選基因進(jìn)行深入的研究。