陳寶莉, 秦 臻, 趙黎明

華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院, 發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心, 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237

N-乙酰氨基葡萄糖是生物體內(nèi)許多重要糖類的組成成分，也是甲殼類動(dòng)物的骨骼和真菌細(xì)胞壁的最小組成單位。N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接形成自然界中來源最廣泛的天然聚糖之一——幾丁質(zhì)(chitin)[1～3]。其年儲(chǔ)量?jī)H次于纖維素[4]。幾丁質(zhì)水溶性差、不利于吸收，因而難以被直接使用于食品和藥品中，而幾丁質(zhì)的水解產(chǎn)物易溶于水、生物相容性好[5]，具有更大的應(yīng)用潛力。研究發(fā)現(xiàn)N-乙酰氨基葡萄糖具有許多重要的生理功能，例如：改善皮膚水合程度、加速傷口愈合、提高人體免疫力、改善骨關(guān)節(jié)炎和抗腫瘤等，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品和化妝品等多個(gè)領(lǐng)域[6～8]。在工業(yè)生產(chǎn)中，N-乙酰氨基葡萄糖目前主要通過降解幾丁質(zhì)制備得到。常用的降解方法包括化學(xué)法和生物法。其中化學(xué)降解主要為酸水解和氧化降解，存在副產(chǎn)物較多、污染嚴(yán)重的問題；相比之下，生物降解法產(chǎn)物純度高，環(huán)境污染小且操作簡(jiǎn)單，成為近年來的研究熱點(diǎn)[9, 10]。生物法降解幾丁質(zhì)涉及多種糖苷水解酶的作用，根據(jù)作用底物和產(chǎn)物類型的不同可分為內(nèi)切型幾丁質(zhì)酶(endochitinase，EC 3.2.1.14)、外切型幾丁質(zhì)酶(exochitinase，EC 3.2.1.29)、幾丁二糖酶(chitobiosidase， EC 3.2.1.29)和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase，EC 3.2.1.52)[11]。其中內(nèi)切型幾丁質(zhì)酶可隨機(jī)水解幾丁質(zhì)糖鏈，得到低聚合度寡糖；外切型幾丁質(zhì)酶和幾丁二糖酶可特異性作用于幾丁質(zhì)的非還原端，得到幾丁二糖或單糖；β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶可作用于幾丁寡糖的非還原端，最終水解得到N-乙酰氨基葡萄糖。

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在自然界中的來源較為豐富，存在于多種動(dòng)植物、細(xì)菌和真菌體內(nèi)。CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cazy.org)依據(jù)蛋白質(zhì)序列進(jìn)化關(guān)系對(duì)糖苷水解酶進(jìn)行歸類，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶主要分布在GH3、GH20、GH84和GH116家族中。本研究涉及的糞腸球菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)重要的菌群之一，其內(nèi)存在豐富的碳水化合物代謝酶系[12～14]，是發(fā)掘高效β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的潛在微生物來源。本研究克隆得到了糞腸球菌來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因EfNagase，成功進(jìn)行了原核異源表達(dá)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，為開發(fā)高穩(wěn)定性的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis,CGMCC 1.2135)由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH5α、BL21(DE3)均購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司(上海)；pET-28a(+)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。DNA Marker DL2000、蛋白Marker均購(gòu)自TaKaRa公司(大連)；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒，SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；TaqDNA聚合酶購(gòu)自Vazyme生物科技有限公司(南京)；限制性內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ購(gòu)自TaKaRa公司(大連)；T4 連接酶購(gòu)自New England Biolabs(美國(guó))；對(duì)硝基苯基-N-乙酰β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-GlcNAc)購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))；幾丁二糖購(gòu)自Megazyme公司(愛爾蘭)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 EfNagase序列分析

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的糞腸球菌來源的GH20家族潛在糖苷水解酶基因序列(GenBank登錄號(hào)：AAO79989.1)，使用DNAMAN軟件分析核酸序列并確定酶切位點(diǎn)；利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物。利用BlastP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析與其他蛋白的序列相似性。使用MEGA 7.0軟件按照Neighbor-joining運(yùn)算方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15～18]。

1.3 EfNagase基因擴(kuò)增與原核表達(dá)

序列分析表明糞腸球菌來源的AAO79989.1基因?yàn)槎嘟Y(jié)構(gòu)域糖苷水解酶，包含一個(gè)GH18家族結(jié)構(gòu)域(N端)及GH20家族結(jié)構(gòu)域(C端)。為了獲得特異性GH20家族β-N-乙酰氨基葡萄糖酶，本研究選取該基因中GH20家族催化區(qū)進(jìn)行進(jìn)一步的克隆表達(dá)研究。

按照細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒說明書，提取Enterococcusfaecalis基因組DNA，并以此為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增GH20家族結(jié)構(gòu)域基因(命名為EfNagase)，上下游引物分別為EfNagase-F：5′-ATTCATGCTAGCAAAAGTGTCTT-TTCCATTGATGC-3′和EfNagase-R：5′-ATTCCGCTCGAGTTATTTAACCACCATATACTCACGAT-3′(下劃線部分別為酶切位點(diǎn)NheⅠ和XhoⅠ)。PCR程序?yàn)椋?4℃ 2 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物并膠回收。膠回收片段與載體pET-28a(+)經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，用T4連接酶連接。將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑單菌落驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，重組質(zhì)粒命名為pET-28a-EfNagase。將重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆在LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫震蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8后，轉(zhuǎn)移至30℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)10 h。用超聲波破碎細(xì)胞獲得粗酶液，離心收集上清液，上樣至已預(yù)平衡的Ni-IDA親和層析柱中，繼續(xù)用平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑)沖洗至OD280小于0.05，再用洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，40 mmol/L咪唑)洗至OD280小于0.05，除去非特異性結(jié)合蛋白，最后用洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，200 mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白并收集目標(biāo)組分，用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純度。

1.4 酶活力的測(cè)定

蛋白含量測(cè)定：采用Bradford法進(jìn)行測(cè)定[19]。取100 μL適當(dāng)稀釋的純酶液，加入1 mL 1×Bradford工作液，迅速混勻后室溫反應(yīng)3 min。以蒸餾水作空白對(duì)照，于595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算純酶液的蛋白含量。

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活的測(cè)定(pNPG法)[20]：取100 μL 2 mmol/L pNP-GlcNAG與50 μL 0.2 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)混勻，50℃預(yù)熱10 min，加入50 μL適當(dāng)稀釋的純酶溶液，迅速混勻50℃反應(yīng)10 min，最后加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。冷卻至室溫，以蒸餾水作空白對(duì)照，于410 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。酶活力單位(U)定義：在上述條件下，每分鐘生成1 μmoL對(duì)硝基苯酚所需的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶量為1個(gè)酶活力單位。

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活的測(cè)定(3,5-二硝基水楊酸，DNS法)[21]：取350 μL溶解在0.2 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的幾丁二糖溶液，再加入50 μL適當(dāng)稀釋的純酶溶液，迅速混勻50℃反應(yīng)10 min，最后加入600 μL DNS溶液，沸水浴煮沸10 min終止反應(yīng)。冷卻至室溫，10 000 r/min離心5 min，取上清液。以蒸餾水作空白對(duì)照，于540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。酶活力單位(U)定義：在上述條件下，每分鐘生成1 μmoL N-乙酰氨基葡萄糖所需的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.5 EfNagase的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.5.1最適溫度及溫度穩(wěn)定性的測(cè)定 將純酶溶液溶于0.2 mol/L pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液并稀釋至適當(dāng)濃度，按1.4中的酶活測(cè)定方法測(cè)定該酶于不同反應(yīng)溫度(35～70℃)下的酶活，以最高酶活點(diǎn)為100%，確定其最適反應(yīng)溫度。

將純酶溶液溶于0.2 mol/L pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液并稀釋至適當(dāng)濃度，于不同溫度條件下(35～60℃)水浴保溫30 min，冰浴冷卻10 min后，按1.4中的酶活測(cè)定方法測(cè)定不同溫度條件下該酶的殘余酶活，以未經(jīng)處理的酶活為100%，確定其溫度穩(wěn)定性。

1.5.2最適pH及pH穩(wěn)定性的測(cè)定 將純酶溶液溶于不同pH緩沖體系(檸檬酸鹽緩沖液：2.5～6.5，磷酸鹽緩沖液：5.5～8.0，Tris-HCl：7.5～9.0，甘氨酸-NaOH：9.0～13.0)中并稀釋至適當(dāng)濃度，按1.4中的酶活測(cè)定方法測(cè)定該酶于不同pH緩沖體系下的酶活，以最高酶活點(diǎn)為100%，確定其最適反應(yīng)溫度。

將純酶溶液分別溶于不同pH緩沖體系中，置于50℃水浴中保溫30 min，冰浴冷卻10 min后，按1.4中酶活測(cè)定方法測(cè)定不同pH緩沖體系中該酶的殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶活為100%，確定其pH穩(wěn)定性。

1.5.3EfNagase底物特異性 分別以天然糖類(殼二糖、殼聚糖、幾丁二糖和幾丁質(zhì))和人工合成的糖苷(pNP-β-D-葡萄糖苷、pNP-GlcNAc)為底物,由于EfNagase對(duì)上述天然糖類的水解活性較低，為了探索EfNagase對(duì)于上述底物是否具有催化能力，采用TLC法分析產(chǎn)物。將適量的天然糖類與純酶溶液混勻50℃水浴保溫1 d，用薄層層析法分析產(chǎn)物組成(展開劑為異丙醇:水:氨水=15∶1∶7.5)。按照1.4中酶活測(cè)定方法測(cè)定EfNagase水解人工合成糖苷的能力，以水解釋放對(duì)硝基苯酚的速率來計(jì)算酶活力。

1.5.4EfNagase動(dòng)力學(xué)參數(shù) 用50 mmol/L pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液配制11個(gè)不同濃度(0.02 mmol/L、0.025 mmol/L、0.04 mmol/L、0.05 mmol/L、0.067 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L)的pNP-GlcNAc底物，加入適宜濃度的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶液，50℃分別反應(yīng)5 min、10 min、15 min、30 min、60 min、120 min，利用Sigma Plot軟件計(jì)算Vmax和Km值。

2 結(jié)果與分析

2.1 EfNagase序列分析

Enterococcusfaecalis來源的GH20家族潛在的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因全長(zhǎng)1 101 bp，編碼367個(gè)氨基酸。通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast結(jié)果顯示EfNagase氨基酸序列與GH20家族中的StreptococcuspneumoniaeTIGR4(AAK76198.1)來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶序列相似度最高，為52.08%。用MEGA 7.0軟件以Neighbor-joining運(yùn)算方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析結(jié)果(圖1)同樣顯示EfNagase與StreptococcuspneumoniaeTIGR4具有最近的進(jìn)化關(guān)系。

圖1 EfNagase與GH20家族不同來源的糖苷水解酶系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of β-N-acetylglucosaminidase fromEnterococcus faecalisand GH20 family.注：基于GH20家族中不同來源的糖苷水解酶氨基酸序列，利用MEGA 7.0軟件采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，序列編號(hào)附于括號(hào)中。

2.2 EfNagase基因擴(kuò)增與原核表達(dá)

以Enterococcusfaecalis基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到EfNagase基因片段，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖2A)得到一條大小約為1 100 bp具有特異性的核酸條帶，符合理論預(yù)期。通過限制性內(nèi)切酶雙酶切反應(yīng)、目的基因與載體的連接反應(yīng)，挑取單菌落測(cè)序?yàn)殛?yáng)性克隆，得到成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-EfNagase。將其轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中后，用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，30℃、200 r/min培養(yǎng)10 h。超聲波破碎細(xì)胞壁，離心取上清液，利用Ni-IDA親和層析柱分離純化。通過SDS-PAGE檢測(cè)純化產(chǎn)物的純度，結(jié)果(圖2B)顯示成功獲得可溶性表達(dá)的高純度的目的蛋白條帶，分子量約為40 kDa，符合預(yù)期。以pNP-GlcNAG為底物檢測(cè)純化后的EfNagase酶學(xué)性質(zhì)，EfNagase的比活力為3 606.1 U/mg；以幾丁二糖為底物檢測(cè)到EfNagase的比活力為352.60 U/mg。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳(A)及重組蛋白SDS-PAGE電泳(B)結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis(A)and SDS-PAGE(B)of recombinant protein fromEnterococcus faecalis.A：M：DNA Marker；1, 2：EfNagase基因PCR產(chǎn)物；B：M：蛋白Marker；1：粗酶液；2：純酶液。

2.3 EfNagase酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1最適溫度和溫度穩(wěn)定性 在相同pH條件下，測(cè)定EfNagase在不同反應(yīng)溫度下(35～70℃)的酶活力。結(jié)果如圖3A所示，EfNagase為中溫酶，在50℃時(shí)酶活最高；當(dāng)溫度高于70℃時(shí)，EfNagase失去活性。將酶液分別孵育于不同溫度(35～70℃)條件下30 min，按標(biāo)準(zhǔn)酶活測(cè)定方法測(cè)其殘余酶活。結(jié)果如圖3B所示，EfNagase在孵育溫度低于50℃時(shí)表現(xiàn)出極高的熱穩(wěn)定性，酶活基本沒有損失，延長(zhǎng)孵育時(shí)間至一周，其殘余酶活仍高于80%；當(dāng)孵育溫度高于50℃，EfNagase的穩(wěn)定性開始降低。

圖3 重組蛋白EfNagase的最適溫度(A)與溫度穩(wěn)定性(B)Fig.3 Optimum temperature(A)and thermostablity(B)of purified recombinant EfNagase.

2.3.2最適pH和pH穩(wěn)定性 在50℃，不同pH緩沖液體系中測(cè)定EfNagase的酶活力。結(jié)果如圖4A所示，EfNagase的最適pH為6.0；當(dāng)pH在5.0～7.0之間時(shí)，相對(duì)酶活高于50%,且當(dāng)pH 5.0～6.5時(shí)，EfNagase在檸檬酸鹽緩沖體系中的相對(duì)酶活比在磷酸鹽緩沖體系中的更高；當(dāng)EfNagase在pH高于7.5的條件下，酶活明顯降低。將酶液分別溶于不同pH緩沖體系中50℃孵育30 min，按標(biāo)準(zhǔn)酶活測(cè)定方法測(cè)定殘余酶活。結(jié)果如圖4B所示，EfNagase具有極高的pH穩(wěn)定性，在很寬的pH范圍內(nèi)(pH 3.5～11.5)殘余酶活均高于90%；當(dāng)pH低于3.0時(shí)，殘余酶活仍維持在70%以上；當(dāng)pH高于12.5，殘余酶活出現(xiàn)了大幅度下降。

圖4 重組蛋白EfNagase的最適pH(A)與pH穩(wěn)定性(B)Fig.4 Optimum pH(A)and pH stability(B)of purified recombinant EfNagase.

2.3.3EfNagase的底物特異性及動(dòng)力學(xué)參數(shù) 分別以天然糖類(殼二糖、殼聚糖、幾丁二糖和幾丁質(zhì))和人工合成的pNP-β-D-葡萄糖苷、pNP-GlcNAc為底物。用TLC檢測(cè)EfNagase水解幾丁二糖的反應(yīng)歷程，結(jié)果如圖5所示，EfNagase可在60 min內(nèi)將幾丁二糖完全水解成為N-乙酰氨基葡萄糖。而EfNagase對(duì)幾丁質(zhì)的水解率很低，且不能水解殼二糖、殼聚糖。用pNPG法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EfNagase對(duì)pNP-GlcNAc表現(xiàn)出高的水解活性，不能水解其他人工合成的pNP底物。結(jié)果表明EfNagase對(duì)幾丁二糖和pNP-GlcNAc有更高的特異性，對(duì)氨基葡萄糖衍生物沒有催化活性。以pNP-GlcNAc為底物，檢測(cè)得到EfNagase的Vmax及Km分別為520.37 μmol/min·mg和0.599 mmol/L。

圖5 薄層層析檢測(cè)EfNagase水解幾丁二糖的反應(yīng)歷程Fig.5 TLC analysis of the time course of chitin disaccharides hydrolyzed by purified EfNagase.M:N-乙酰氨基葡萄糖與幾丁二糖標(biāo)準(zhǔn)品; 5,10,15,30,60,120:分別表示EfNagase水解反應(yīng)了5 min,10 min,15 min,30 min,60 min,120 min。

3 討論

N-乙酰氨基葡萄糖由于其眾多重要的生理活性而備受關(guān)注，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作為酶法綠色制備N-乙酰氨基葡萄糖中具有重要意義的水解酶之一，也受到學(xué)者的廣泛研究。本研究從糞腸球菌中克隆得到的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EfNagase)，通過相似度比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定其應(yīng)歸屬GH20家族糖苷水解酶。目前，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶主要分布在GH3、GH20、GH84和GH116家族中，其中GH20家族的發(fā)現(xiàn)和研究最多。雖然目前已有報(bào)道的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶很多，但普遍存在酶活較低的缺點(diǎn)，大約超過70%的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活低于100 μmol/min·mg[22]。相對(duì)于其他家族的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，GH20家族的酶活更高，Microbacteriumsp.來源[23]的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶水解pNP-GlcNAc的比活力為1 773.1 μmol/min·mg，水解幾丁二糖的比活為481.4 μmol/min·mg；Shinellasp.來源[24]的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶水解pNP-GlcNAc的比活力為538.8 μmol/min·mg，水解幾丁二糖的比活為35.4 μmol/min·mg。EfNagase以pNP-GlcNAc為底物的比活為3 606.10 U/mg，以幾丁二糖為底物的比活力為352.60 U/mg，已遠(yuǎn)高于多數(shù)其他來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。EfNagase在溫度50°C、pH 6.0的條件下活性最高，這和其他多數(shù)β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶性質(zhì)相近。近60%的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的最適溫度在37～50℃，最適pH多在5～8之間[25]。EfNagase展現(xiàn)出了良好的溫度穩(wěn)定性，在溫度低于50℃的條件下孵育一周，其殘余酶活仍高于80%；且具有良好的pH穩(wěn)定性，在pH 3.5～11.5的范圍內(nèi)展現(xiàn)出高的穩(wěn)定性(殘余酶活>90%)。適用于大部分食品、化學(xué)和醫(yī)藥工業(yè)的生產(chǎn)條件。研究還表明EfNagase對(duì)pNPG和幾丁二糖有較強(qiáng)的水解活性和底物特異性。EfNagase的優(yōu)良性質(zhì)為其在食品、化學(xué)、醫(yī)藥工業(yè)以及環(huán)境生物技術(shù)等領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。