張文倩, 王亞梁, 朱德峰, 陳惠哲, 向 鏡, 張義凱, 武 輝, 胡國(guó)輝, 易子豪, 張玉屏

中國(guó)水稻研究所, 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310006

水稻是我國(guó)主要糧食作物，大約60%的人口以稻米為口糧。1960年以來(lái)，我國(guó)地表平均溫度升高了1.2℃，根據(jù)預(yù)測(cè)，到21世紀(jì)末，我國(guó)地表溫度還將上升2.2℃～4.2℃[1]。而溫度與水稻產(chǎn)量又有著密切聯(lián)系。Peng等[2]指出日最低溫度升高1℃，水稻減產(chǎn)10%。水稻品質(zhì)形成的關(guān)鍵時(shí)期是灌漿期，有研究表明，夜溫升高影響了水稻籽粒干物質(zhì)的積累和稻米品質(zhì)[3]；但也有研究認(rèn)為，夜溫升高加快了灌漿速率，且并未引起千粒重的下降[4]。

水稻籽粒中糙米90%的物質(zhì)來(lái)源于淀粉，而淀粉是籽粒灌漿過(guò)程中主要的積累產(chǎn)物，其合成的過(guò)程主要包括蔗糖分解、淀粉積累。蔗糖是糖分運(yùn)輸和貯存的主要形式，其可降解為葡萄糖，轉(zhuǎn)化為葡萄糖供體，之后用于合成淀粉[5]。在籽粒灌漿時(shí)期，籽粒中蔗糖的含量及其代謝相關(guān)酶的活性起著非常重要的作用。蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)和蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS)是蔗糖進(jìn)入各種代謝途徑所必需的關(guān)鍵酶，其中SS活性與籽粒淀粉的積累速率呈極顯著正相關(guān)[6]。任雷[7]的研究表明，溫度越高，越有利于甜瓜果實(shí)糖分的積累和蔗糖相關(guān)酶的表達(dá)?？扇苄缘矸酆铣擅?soluble starch synthase，SSS)和淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)是灌漿過(guò)程中淀粉合成的關(guān)鍵酶[8]。研究表明，高溫處理下籽粒中SSS和SBE的活性會(huì)升高，直至峰值后下降[9]。

然而，目前還沒(méi)有針對(duì)夜溫升高對(duì)日間及夜間淀粉代謝生理過(guò)程的影響的研究，基于此，本研究以優(yōu)質(zhì)稻黃華占為材料，研究夜溫升高對(duì)不同灌漿時(shí)期的淀粉及蔗糖生理代謝變化的影響，以期明確水稻籽粒灌漿過(guò)程中氣候變化對(duì)籽粒物質(zhì)積累的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料與盆栽方法

本研究于2017年在杭州市中國(guó)水稻研究所人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行。采用盆栽種植，土壤基礎(chǔ)肥力為pH 5.93、有機(jī)質(zhì)28.26 g/kg、全氮1.50 g/kg、堿解氮128.24 mg/kg、全磷0.87 g/kg、有效磷44.8 mg/kg、全鉀25.27 g/kg、速效鉀13 mg/kg。供試品種(組合)為優(yōu)質(zhì)秈稻黃華占(HHZ)，為大面積生產(chǎn)的主推品種，主莖葉片數(shù)14片，生育期130 d左右。

采用基質(zhì)塑盤(pán)育秧，秧苗為3葉1心時(shí)移栽至裝有過(guò)篩均勻的田間細(xì)土的塑料盆中(規(guī)格：長(zhǎng)×寬×高=20 cm×18 cm×25 cm)，每盆裝過(guò)篩均勻干土10 kg，每盆種植生長(zhǎng)狀態(tài)一致的秧苗2穴，每穴2棵苗，每個(gè)處理6盆。每盆施用復(fù)合肥(N∶P∶K=15∶15∶15)3.0 g做為基肥，分蘗期施用尿素0.6 g，穗分化開(kāi)始時(shí)施復(fù)合肥(N∶P∶K=15∶15∶15)1.8 g作為穗肥。其他管理措施同常規(guī)栽培，塑料盆內(nèi)水層保持在2～3 cm。

1.2 試驗(yàn)處理與溫度控制

于水稻灌漿初期P1(開(kāi)花后的前10 d)、灌漿中期P2(開(kāi)花后11～20 d)和灌漿后期P3(開(kāi)花后21～30 d)，將生長(zhǎng)發(fā)育基本一致的稻株單穗進(jìn)行掛牌標(biāo)記，整盆移入玻璃人工氣候箱內(nèi)，自然光照，處理結(jié)束后再移入室外讓其自然生長(zhǎng)，直至籽粒成熟。根據(jù)長(zhǎng)江中下游地區(qū)單季稻灌漿期間夜間溫度變化，3個(gè)處理組的溫度設(shè)定(具體見(jiàn)表1)：0:00～7:00和16:00～24:00分別為21.0℃(T1)、25.0℃(T2，對(duì)照)、29.0℃(T3)，7:00～9:00分別為24.5℃、26.5℃、30.5℃，9:00～14:00均為32.0℃，14:00～16:00分別為29.5℃、30.5℃、31.5℃。氣候箱內(nèi)空氣相對(duì)濕度為75%。

表1 人工氣候箱溫度設(shè)置Table1 Temperature setting of climate chamber.

1.3 測(cè)定項(xiàng)目和方法

于每一階段處理結(jié)束當(dāng)天取樣，分別于日間12:00～13:00和夜間22:00～23:00進(jìn)行。取標(biāo)記穗中部同一部位籽粒，取樣樣品置于-80℃保存。

1.3.1蔗糖和淀粉含量測(cè)定 蔗糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法[10]，淀粉含量、支鏈淀粉含量和直鏈淀粉含量測(cè)定參照何照范[11]的方法。

1.3.2蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性測(cè)定

蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性測(cè)定參照夏叔芳等[12]的方法。

1.3.3可溶性淀粉合成酶活性和淀粉分支酶活性測(cè)定 可溶性淀粉合成酶活性測(cè)定參照李天等[13]的方法，淀粉分支酶活性測(cè)定參照趙法茂等[14]的方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及作圖，利用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(Duncan’s)。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒蔗糖和淀粉含量

由圖1A可知，T1處理的平均蔗糖含量為6.7 mg/g(鮮重)，T2處理的平均蔗糖含量為6.2 mg/g(鮮重)，T3處理的平均蔗糖含量為6.4 mg/g(鮮重)，即平均蔗糖含量：T1>T3>T2。在P1時(shí)期，不同夜溫處理蔗糖含量差異最明顯，T2、T3處理的蔗糖含量基本相同，較T2、T3處理，T1處理的蔗糖含量增加了18.2%，而在P2、P3時(shí)期，T1處理的蔗糖含量最高，T3處理的蔗糖含量高于T2處理。由圖1B可知，在P1時(shí)期，淀粉含量在不同溫度處理下差異顯著，T3處理的淀粉含量顯著高于其他2個(gè)處理，較T1、T2處理，T3處理的淀粉含量分別上升了14.0%、20.6%。說(shuō)明籽粒內(nèi)部蔗糖含量的變化差異主要在P1時(shí)期和P3時(shí)期，而淀粉含量變化差異主要在P1時(shí)期。

2.2 支鏈淀粉和直鏈淀粉含量

淀粉包括支鏈淀粉和直鏈淀粉2種。從圖2A可見(jiàn)，P2時(shí)期的不同夜溫處理下籽粒中支鏈淀粉的含量差異顯著，隨著夜溫升高支鏈淀粉含量下降，與T1處理相比，T2處理和T3處理分別下降了10.39%和33.23%。而P1時(shí)期T3處理支鏈淀粉含量最高，P3時(shí)期不同處理間差異較小。說(shuō)明在灌漿初期(P1)夜溫升高利于支鏈淀粉的合成，而灌漿中期(P2)夜溫升高不利于支鏈淀粉的合成。

由圖2B可知，在不同時(shí)期，T3處理的直鏈淀粉含量均高于其他處理，且在P1時(shí)期差異最顯著，較T1、T2處理，T3處理的直鏈淀粉含量分別上升了273.3%、13.4%。灌漿期夜溫升高使直鏈淀粉含量明顯增加，且水稻灌漿初期(P1)籽粒直鏈淀粉含量上升最顯著，說(shuō)明此時(shí)為影響直鏈淀粉含量的敏感時(shí)期。

2.3 可溶性淀粉合成酶(SSS)和淀粉分支酶(SBE)活性

在籽粒灌漿過(guò)程中，SSS和SBE是淀粉合成的關(guān)鍵酶。從圖3可看出，無(wú)論在日間還是夜間，T3處理下SSS活性均較小，且在P1、P2時(shí)期較T1處理酶活性顯著下降，說(shuō)明灌漿初期(P1)和中期(P2)夜溫升高，SSS活性顯著下降。

圖1 不同溫度處理籽粒蔗糖(A)和淀粉(B)的含量Fig.1 The contents of sucrose(A)and starch(B)in grains under different temperature treatments.注：不同字母代表同一時(shí)期不同溫度處理間差異顯著(P<0.05)。

圖2 不同溫度處理籽粒支鏈淀粉(A)和直鏈淀粉(B)的含量Fig.2 The contents of amylose(A)and amylopectin(B)in grains under different temperature treatments.注：不同字母代表同一時(shí)期不同溫度處理間存在顯著差異(P<0.05)。

圖3 不同溫度處理籽?？扇苄缘矸酆铣擅?SSS)和淀粉分支酶(SBE)的活性Fig.3 The activity of soluble starch synthetase(SSS)and starch branching enzyme(SBE)in grainsunder different temperature treatments.注：A.不同溫度處理在不同時(shí)期日間SSS的活性; B.不同溫度處理在不同時(shí)期夜間SSS的活性; C.不同溫度處理在不同時(shí)期日間SBE的活性; D.不同溫度處理在不同時(shí)期夜間SBE的活性。不同字母代表同一時(shí)期不同溫度處理間差異顯著(P<0.05)。

而SBE與SSS對(duì)溫度的敏感程度并不相同。日間T3處理下P1、P2時(shí)期SBE活性明顯低于其他2個(gè)處理，表現(xiàn)為溫度升高酶活性下降，P3時(shí)期3個(gè)溫度處理下酶活性差異不顯著；夜間T3處理的酶活性依舊最小(平均為116.64 U/g FW)，但T2處理的酶活性最大(平均為239.2 U/g FW)，這與日間酶活性變化趨勢(shì)不一致，即夜間SBE酶活性在高溫與低溫條件下均較低。圖3主要說(shuō)明T3處理(夜溫29℃)下SSS和SBE的酶活性均降低，不利于籽粒淀粉的正常合成，且P1和P2時(shí)期夜溫升高顯著影響二者活性。

2.4 蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性

SS與SPS均為蔗糖進(jìn)入各種代謝途徑所必需的關(guān)鍵酶，其活性反映蔗糖生物合成途徑的能力，但隨著夜溫升高，其響應(yīng)不一致。由圖4可知，SS活性在日間和夜間變化趨勢(shì)一致，P1時(shí)期，相對(duì)于其他2個(gè)處理，T3處理下酶活性顯著下降，P2時(shí)期T2處理和T3處理下酶活性顯著下降。說(shuō)明SS活性受到夜溫升高的影響：P1時(shí)期夜間外界溫度升高至29℃時(shí)，酶活性顯著下降；P2時(shí)期外界夜間溫度≥25℃，酶活性顯著下降。

夜溫升高同樣顯著影響了SPS活性。P1時(shí)期，相對(duì)于其他2個(gè)處理，T3處理日間SPS活性顯著升高，但夜間酶活性顯著降低。然而，在P2時(shí)期對(duì)比T1處理，T3處理和T2處理日間SPS活性顯著降低，但夜間SPS活性有所升高。P3時(shí)期，各個(gè)溫度處理差異不大。綜上所述，SPS活性在P1時(shí)期，夜溫升高日間酶活性增大，夜間酶活性降低，P2時(shí)期則反之。說(shuō)明日間酶活性也會(huì)受到夜溫升高的影響，且SPS對(duì)外界溫度變化敏感。

圖4 不同溫度處理蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性Fig.4 Activity of sucrose synthetase(SS)and sucrose phosphate synthetase(SPS)in grains under differenttemperature treatments.注：A.不同溫度處理在不同時(shí)期日間SS的活性; B.不同溫度處理在不同時(shí)期夜間SS的活性; C.不同溫度處理在不同時(shí)期日間SPS的活性; D.不同溫度處理在不同時(shí)期夜間SPS的活性。不同字母代表同一時(shí)期不同溫度處理間存在顯著差異(P<0.05)。

3 討論

本研究結(jié)果表明水稻開(kāi)花后的P1時(shí)期和P2時(shí)期籽粒淀粉和蔗糖代謝相關(guān)酶活性受夜溫升高的影響較大，其中P1時(shí)期是淀粉代謝對(duì)夜溫變化最敏感的時(shí)期。灌漿初期(P1)，夜溫升高淀粉含量顯著上升，直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量也隨之上升，蔗糖含量下降；SSS、SBE和SS活性下降，SPS日間酶活性上升而夜間下降，這說(shuō)明夜溫升高對(duì)酶活性的影響具有持續(xù)效應(yīng)，即日間酶活性也會(huì)受到夜溫升高的影響。

灌漿初期(P1)為夜溫升高對(duì)淀粉積累影響的敏感時(shí)期。而后2個(gè)時(shí)期的溫度處理，對(duì)淀粉積累影響較小。這與呂艷梅等[15]研究灌漿期高溫對(duì)水稻籽粒淀粉形成的影響的結(jié)果相似，但其也表明高溫易使灌漿提前結(jié)束。從品質(zhì)角度出發(fā)，直鏈淀粉的含量是影響稻米品質(zhì)的重要因素。有研究表明，直鏈淀粉含量低，稻米食味值較好[16,17]。而在本研究中，直鏈淀粉含量均隨著夜溫升高而增加，且在P1時(shí)期增幅最顯著，可見(jiàn)此時(shí)是影響直鏈淀粉含量的敏感時(shí)期，夜溫升高影響了水稻的稻米品質(zhì)，這與張桂蓮等[18]的研究結(jié)果相似，其認(rèn)為抽穗結(jié)實(shí)期高溫使直鏈淀粉含量增加。

Mayer等[19]和Wilhelm等[20]指出，SSS對(duì)高溫十分敏感，也有研究表示灌漿早期高溫處理可明顯提高SSS的酶活性[21]。通過(guò)本研究可以發(fā)現(xiàn)，P1和P2時(shí)期夜間溫度升高，使得HHZ日間和夜間SSS酶活性均顯著降低，且在P1時(shí)期日間與夜間不同溫度處理SSS活性差異最明顯。而SBE在P1時(shí)期夜間高溫與低溫活性均較低，這與金正勛等[22]的研究結(jié)果相吻合，其發(fā)現(xiàn)SBE活性對(duì)溫度變化的響應(yīng)較為迅速，溫度過(guò)高或過(guò)低該酶的活性都會(huì)降低。

SPS利于降解后的運(yùn)輸產(chǎn)物在其催化下形成蔗糖，由本研究結(jié)果可知，P1時(shí)期高夜溫減緩夜間籽粒內(nèi)蔗糖合成，P2時(shí)期高夜溫減緩日間籽粒內(nèi)蔗糖合成。而SS的主要作用是催化蔗糖分解成葡萄糖和果糖，為淀粉合成提供底物。本研究中，SS在不同夜溫下其活性差異明顯，在P1時(shí)期夜溫29℃時(shí)，其酶活性最小，即在高夜溫下通過(guò)蔗糖合成酶途徑分解蔗糖的能力下降，此時(shí)可能影響籽粒內(nèi)的淀粉合成，也有研究表明[14]高溫會(huì)抑制灌漿期籽粒蔗糖合成酶活性，可能會(huì)導(dǎo)致淀粉合成受阻。

在本研究中，淀粉含量隨著夜溫升高而上升，然而，灌漿過(guò)程中淀粉合成的關(guān)鍵酶，可溶性淀粉合成酶和淀粉分支酶，活性均下降。這主要是由于籽粒內(nèi)淀粉積累合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，水稻淀粉的合成需要通過(guò)一系列酶促反應(yīng)完成，除了本研究已測(cè)定的可溶性淀粉合成酶和淀粉分支酶，還包括ADPG焦磷酸化酶、顆粒結(jié)合型淀粉合酶、淀粉去分支酶和淀粉磷酸化酶[23]。因而，在后續(xù)試驗(yàn)中可基于此展開(kāi)深入的研究。此外，本次研究中試驗(yàn)時(shí)期獨(dú)立分為3個(gè)階段，并未對(duì)灌漿全過(guò)程中不同階段進(jìn)行探究，且設(shè)置3個(gè)溫度處理，溫差分別為3℃、7℃、11℃，而目前較小幅度的夜間增溫對(duì)水稻灌漿影響的生理機(jī)制，以及夜間增溫與日間增溫對(duì)籽粒結(jié)實(shí)具體影響的差異尚不明確，有待進(jìn)一步探索。