鐘丘實, 李 莉, 陳新丹, 張 京, 徐維娜, 徐建雄

上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室, 上海 200240

生物體內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧自由基會導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激，從而對機體造成各種氧化損傷。這種氧化損傷已被證實與諸多疾病相關(guān)，如心血管疾病、癌癥等[1～3]。研究表明，使用抗氧化劑緩解氧化應(yīng)激及其引發(fā)的氧化損傷，可以有效緩解各種疾病的癥狀，如褪黑素可緩解蛛網(wǎng)膜下出血引發(fā)的早期腦損傷，牡荊素可緩解急性肺損傷，原花青素可抑制小鼠結(jié)腸炎[4～7]。

益生菌是一類能夠通過復(fù)雜的機制影響宿主共生菌群，進而調(diào)節(jié)宿主的上皮和免疫反應(yīng)的有益的活性微生物[8]。一些益生菌及其微生態(tài)制劑具有良好的抗氧化能力，能夠有效抑制機體內(nèi)的氧化應(yīng)激，維持腸道和機體健康[1,9]。乳桿菌是益生菌中一種被廣泛研究、認可的功能性天然抗氧化劑，具有一定的自由基清除能力和抗氧化酶活性[10,11]，也有研究報道，不同的乳桿菌菌株在抗氧化能力及機制上存在著明顯的差異[11～13]。

基于此，本研究分析比較植物乳桿菌(L.plantarumCGMCC 1.557)和干酪乳桿菌(L.caseiCGMCC 1.570)的全發(fā)酵培養(yǎng)物及其不同組分的抗氧化能力，以期確定其抗氧化組分，為進一步開發(fā)利用基于這2株乳桿菌的功能性成分提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌L.plantarumCGMCC 1.557和干酪乳桿菌L.caseiCGMCC 1.570由上海創(chuàng)博生態(tài)工程有限公司農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心提供。

MRS培養(yǎng)液由上海創(chuàng)博生態(tài)工程有限公司農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心提供；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)和L-抗壞血酸(維生素C)購自上海麥克林生化科技有限公司；1,10-菲羅啉(鄰二氮菲)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；七水合硫酸亞鐵(分析純AR)購自國藥集團；10×PBS購自生工生物工程(上海)股份有限公司；超氧陰離子自由基清除率(南京建成A052)、總超氧化物歧化酶(T-SOD，南京建成A001-1-1)、過氧化氫酶(CAT，南京建成A007-1-1)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，南京建成A005)檢測試劑盒均購自南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；JY92-II型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝科器研究所)；SYNERGY 2多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；HWS12型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 樣品制備

植物乳桿菌(L.plantarum)和干酪乳桿菌(L.casei)的培養(yǎng)：2株乳桿菌分別在MRS液體培養(yǎng)基中恒溫(32℃)靜置培養(yǎng)48 h，得到2株乳桿菌的發(fā)酵原液。

全發(fā)酵培養(yǎng)物：將發(fā)酵原液用MRS培養(yǎng)液稀釋至細胞濃度為1×109CFU/mL。

發(fā)酵上清液(S)：將已稀釋好的全發(fā)酵培養(yǎng)物于4℃、6 000 r/min離心15 min，收集上清液即為發(fā)酵上清液。

菌體懸浮液(C)：在制備過程(S)中收集沉淀(菌體),用適量無菌生理鹽水懸浮洗滌，再于4℃、6 000 r/min離心10 min，棄上清液后再用無菌生理鹽水懸浮洗滌。將這一洗滌過程重復(fù)2次，并最終用無菌生理鹽水重懸至細胞濃度為1×109CFU/mL，即菌體懸浮液。

胞內(nèi)提取物(E)：參考蔣雨鶴等[14]的方法，將制備過程(C)所得菌體懸浮液冰浴超聲破碎，功率為250 W,超聲處理5 s，間隔5 s，總超聲時間為40 min。破碎后于4℃、8 800 r/min離心10 min。保留上清液，即得到胞內(nèi)提取物。

維生素C溶液(VC)：臨用前，用去離子水作為溶劑，配制0.15 mg/mL的維生素C溶液。

1.4 自由基清除率測定

1.4.1DPPH·清除率測定 參考Li等[15]的方法，并略作改動。將0.5 mL樣品和1 mL DPPH·溶液(0.2 mmol/L，溶于無水乙醇)充分混勻，室溫條件下避光反應(yīng)30 min。隨后于517 nm處測定其吸光值。各樣品組的吸光值記為A樣品；對照組以0.5 mL無水乙醇代替DPPH·溶液，吸光值記為A對照；空白組以0.5 mL無水乙醇代替樣品溶液，吸光值記為A空白。

DPPH·清除率=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100%

1.4.2·OH清除率測定 參考蔣雨鶴等[14]的方法，并略作改動。取1 mL 0.02 mol/L PBS(pH 7.4)于離心管中，加入1 mL 2.5 mmol/L鄰二氮菲充分混勻。之后加入1 mL 2.5 mmol/L FeSO4溶液并立即混勻。再加入0.5 mL樣品溶液和1 mL 0.02 mol/L H2O2溶液，混勻后于37℃水浴1.5 h，取出后立即冰浴。在536 nm處測定其吸光值。各樣品組的吸光值記為A樣品；對照組以去離子水代替樣品溶液，吸光值記為A對照；空白組以去離子水代替樣品和H2O2溶液，吸光值記為A空白。

·OH清除率=(A樣品-A對照)/( A空白-A對照)×100%

1.4.3O2·-清除率測定 按照相應(yīng)的試劑盒說明書操作。

1.5 T-SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性測定

按照相應(yīng)的試劑盒說明書操作。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，利用SPSS 20.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。先進行方差齊次性檢驗，再進行獨立樣本t檢驗(雙側(cè))或單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 全發(fā)酵培養(yǎng)物的抗氧化能力

為了明確2株乳桿菌的抗氧化能力，本研究先測定了全發(fā)酵培養(yǎng)物的3種主要自由基清除率。由圖1可知，2株乳桿菌全發(fā)酵培養(yǎng)物的O2·-清除率、·OH清除率都顯著高于陽性對照維生素C(P<0.05)，干酪乳桿菌全發(fā)酵培養(yǎng)物的O2·-清除率顯著高于植物乳桿菌(1.1倍，P<0.05)，而·OH清除率顯著低于植物乳桿菌(0.75倍，P<0.05)。結(jié)果說明2株乳桿菌都具有較好的抗氧化能力，且在整體上二者間并沒有太大差異。

圖1 植物乳桿菌和干酪乳桿菌全發(fā)酵培養(yǎng)物的自由基清除率Fig.1 The scavenging rates of free radicals by all fermented cultures ofL.plantarumandL.casei.注：不同小寫字母表示同一自由基的不同處理之間有顯著性差異(P<0.05)。n=6。

為了判斷2株乳桿菌的抗氧化能力是否和抗氧化酶相關(guān)，接著測定了乳桿菌全發(fā)酵培養(yǎng)物的3種主要抗氧化酶活性。由圖2可知，2株乳桿菌全發(fā)酵培養(yǎng)物的T-SOD和GSH-Px活性沒有顯著性差異(P>0.05)，而植物乳桿菌全發(fā)酵培養(yǎng)物的CAT活性顯著高于干酪乳桿菌(1.2倍，P<0.05)。結(jié)果顯示，2株菌的全發(fā)酵培養(yǎng)物都具有明顯的抗氧化酶活性，證實2株菌的抗氧化能力與抗氧化酶相關(guān)。

圖2 植物乳桿菌和干酪乳桿菌全發(fā)酵培養(yǎng)物的抗氧化酶活性Fig.2 The antioxidase activity of all fermented cultures ofL.plantarumandL.casei.注：不同小寫字母表示同一抗氧化酶的不同處理之間有顯著性差異(P<0.05)。n=6。

2.2 不同組分的抗氧化能力

為了進一步確定2株乳桿菌全發(fā)酵培養(yǎng)物各組分的抗氧化能力，分別制備了2株乳桿菌的發(fā)酵上清液(S)、菌體懸浮液(C)和胞內(nèi)提取物(E)，測定了各組分的自由基清除率和抗氧化酶活性。由圖3A可知，2株乳桿菌的發(fā)酵上清液對DPPH·清除率顯著高于各自的菌體懸浮液及胞內(nèi)提取物(3.93～5.72倍)，但2株菌同一組分之間的DPPH·清除率沒有顯著性差異(P>0.05)。2株菌各組分的O2·-清除率從高到低依次為發(fā)酵上清液、菌體懸浮液、胞內(nèi)提取物，且各組分間差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；干酪乳桿菌發(fā)酵上清液的O2·-清除率顯著高于植物乳桿菌(1.28倍，P<0.05)，但干酪乳桿菌的菌體懸浮液和胞內(nèi)提取物的O2·-清除率都分別顯著低于植物乳桿菌的相應(yīng)組分(P<0.05)(圖3B)。2株菌各組分的·OH清除率從高到低依次為菌體懸浮液、發(fā)酵上清液、胞內(nèi)提取物，且各組分間差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；植物乳桿菌菌體懸浮液的·OH清除率顯著高于干酪乳桿菌(1.34倍，P<0.05)(圖3C)。

圖3 不同組分的自由基清除率Fig.3 The scavenging rates of free radicals by different ingredients.注：A：DPPH·清除率；B：O2·-清除率；C：·OH清除率。不同小寫字母表示同一株菌不同組分之間有顯著性差異(P<0.05)；*表示2株菌的相同組分之間有顯著性差異(P<0.05)。n=6。

圖4 不同組分的抗氧化酶活性Fig.4 The antioxidase activity of different ingredients.注：A：T-SOD活性；B：CAT活性；C：. GSH-Px活性。不同小寫字母表示同一株菌不同組分之間有顯著性差異(P<0.05)；*表示表示2株菌的相同組分之間有顯著性差異(P<0.05)。n=5。

由圖4A可知，2株乳桿菌各組分的T-SOD活性從高到低依次為發(fā)酵上清液(S)、菌體懸浮液(C)、胞內(nèi)提取物(E)，且各組分間差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；植物乳桿菌發(fā)酵上清液的T-SOD活性顯著高于干酪乳桿菌(1.25倍，P<0.05)，而干酪乳桿菌菌體懸浮液的T-SOD活性是植物乳桿菌的1.7倍(P<0.05)。植物乳桿菌發(fā)酵上清液的CAT活性顯著高于菌體懸浮液和胞內(nèi)提取物(P<0.05)，干酪乳桿菌胞內(nèi)提取物的CAT活性顯著低于發(fā)酵上清液和菌體懸浮液(P<0.05)(圖4B)。植物乳桿菌菌體懸浮液GSH-Px活性顯著高于胞內(nèi)提取物(P<0.05)，干酪乳桿菌胞內(nèi)提取物的GSH-Px活性顯著低于發(fā)酵上清液和菌體懸浮液(P<0.05)(圖4C)。

綜上所述，2株乳桿菌不同組分的抗氧化能力并不相同，且差異顯著；整體上，2株菌的發(fā)酵上清液和菌體懸浮液具有更好的抗氧化能力，而胞內(nèi)提取物的抗氧化能力較弱。不同組分之間的抗氧化能力產(chǎn)生差異，一方面是由于抗氧化酶活性的差異，另一方面也可能與2株菌合成分泌的其他非酶類活性物質(zhì)的抗氧化能力相關(guān)，值得進一步探討。

3 討論

植物乳桿菌和干酪乳桿菌都是益生菌的一員，相繼被報道具有不同程度的抗氧化能力[16,17]。本研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌L.plantarumCGMCC 1.557和干酪乳桿菌L.caseiCGMCC 1.570都具有良好的抗氧化能力，2株乳桿菌全發(fā)酵培養(yǎng)物的3種自由基清除率都比較高；而2株菌的發(fā)酵上清液和菌體懸浮液相比各自的胞內(nèi)提取物,在整體上具有更高的自由基清除率。進一步研究發(fā)現(xiàn)，2株乳桿菌全發(fā)酵培養(yǎng)物都具有較高的T-SOD和GSH-Px活性，也因此會表現(xiàn)出較高的O2·-清除率和·OH清除率，這和一些已有的研究結(jié)果一致[12,13,18]。在機體中，T-SOD是最高效的清除O2·-的酶；CAT專職催化分解H2O2；GSH-Px則是主要的過氧化物分解酶。然而本研究發(fā)現(xiàn)2株乳桿菌全發(fā)酵培養(yǎng)物的CAT活性較低，但·OH清除率較高，這可能是因為有非酶類的物質(zhì)參與了羥自由基的清除過程[19]。

此外，研究分析發(fā)現(xiàn)不同成分清除自由基的能力不同，2株乳桿菌發(fā)酵上清液和菌體懸浮液的自由基清除率的高低和酶活性的高低并不完全對應(yīng)。這可能是菌體表面以及菌體生長過程中分泌代謝的物質(zhì)也積極參與了自由基的清除過程，如巰基化合物、胞外多糖等[20,21]。在本研究結(jié)果中，干酪乳桿菌的發(fā)酵上清液相比植物乳桿菌具有更高的O2·-清除率(1.28倍)，但其T-SOD活性卻更低(0.80倍)；反之，植物乳桿菌的菌體懸浮液的O2·-清除率顯著高于干酪乳桿菌(1.54倍)，但T-SOD活性卻顯著低于干酪乳桿菌菌體懸浮液(0.59倍)，這說明植物乳桿菌和干酪乳桿菌的菌體提供的非酶類抗氧化物質(zhì)發(fā)揮了重要的作用[10,16]。

從本研究結(jié)果可以看到，與發(fā)酵上清液、菌體懸浮液相比，胞內(nèi)提取物抗氧化能力稍低，然而一些文獻的數(shù)據(jù)顯示，某些菌株的胞內(nèi)提取物也有著不弱于菌液其他組分的抗氧化能力[12,14,17]。這可能是因為檢測方法和反應(yīng)體系的不同，或者是菌株的不同[16～18,22]。此外，比較同一株菌的各組分可發(fā)現(xiàn)，2株乳桿菌的發(fā)酵上清液的DPPH·和O2·-清除率最高，而菌體懸浮液的·OH清除率最高。因此，值得探討和進一步研究的是，胞內(nèi)的抗氧化酶，在乳桿菌清除自由基的過程中，具體如何參與菌體的抗氧化過程：是外界高自由基環(huán)境促使乳桿菌本身攝入自由基，從而在菌體內(nèi)清除自由基，還是高自由基環(huán)境會促使乳桿菌釋放胞內(nèi)抗氧化酶到菌體外部？倘若能夠洞悉這一過程，那么對于理解乳桿菌的抗氧化過程將有所助益。

綜上所述，本研究主要分析并確定了植物乳桿菌L.plantarumCGMCC 1.557和干酪乳桿菌L.caseiCGMCC 1.570的全發(fā)酵培養(yǎng)物及其不同組分的抗氧化能力，并且從不同組分的自由基清除率以及抗氧化酶活性的角度進行研究，進一步發(fā)現(xiàn)2株乳桿菌的發(fā)酵上清液和菌體是其具備抗氧化能力的關(guān)鍵。同時，其能清除自由基除依賴抗氧化酶外，還有乳桿菌合成、分泌的非酶類抗氧化物質(zhì)的參與。這2株乳桿菌的全發(fā)酵培養(yǎng)物及菌體都具有進一步開發(fā)的潛力和價值。