徐長祿, 趙艷紅, 馬藝戈, 王冰蕊, 王 鼎, 郭 青, 佟靜媛, 高 潔, 李亞樸, 劉金花, 石莉紅

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院(血液學(xué)研究所), 實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300020

細(xì)胞自噬是指在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下，降解細(xì)胞自身受損或無關(guān)細(xì)胞器，以此維持細(xì)胞自身的更新和活力。細(xì)胞自噬可以分為巨自噬、微自噬及分子伴侶介導(dǎo)的自噬3種形式，當(dāng)細(xì)胞受到饑餓、缺氧、病原體感染等因素刺激時(shí)，即可啟動細(xì)胞自噬[1,2]。

人體紅細(xì)胞為造血譜系中的一支，由具有多向分化潛能的造血干細(xì)胞分化而來[3]。成熟紅細(xì)胞的生成需要多種生物學(xué)過程參與，而細(xì)胞自噬在紅細(xì)胞生成過程中發(fā)揮著重要作用，尤其是紅細(xì)胞終末分化階段的線粒體、核糖體及其他細(xì)胞器的清除過程[4]。但是，有關(guān)自噬相關(guān)基因在人體紅細(xì)胞終末分化各階段的整體表達(dá)概況及其生物學(xué)作用的研究尚無報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)方法對人體原始紅細(xì)胞、早期早幼紅細(xì)胞、晚期早幼紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞及晚幼紅細(xì)胞5個(gè)階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以期探討自噬相關(guān)基因在各階段的動態(tài)表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及類型

紅細(xì)胞終末分化各階段轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于已發(fā)表文獻(xiàn)[5]，An等[5]通過流式細(xì)胞儀檢測、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及功能性實(shí)驗(yàn)分選出每個(gè)階段的細(xì)胞，然后對各階段紅系終末分化細(xì)胞(人體原始紅細(xì)胞、早期早幼紅細(xì)胞、晚期早幼紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞和晚幼紅細(xì)胞)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，每個(gè)階段3個(gè)重復(fù)。本研究下載上述5個(gè)階段紅細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對3個(gè)重復(fù)取平均值，從中選取自噬相關(guān)基因的表達(dá)值。

1.2 自噬相關(guān)基因集的獲得

人體自噬相關(guān)基因集取自Autophagy Database[6]和Autophagy Regulatory Network(ARN)[7]，兩者取交集獲得人體自噬相關(guān)基因747個(gè)。

1.3 基因注釋

基因注釋由DAVID[8]完成，DAVID為經(jīng)典的基因注釋數(shù)據(jù)庫，基因注釋信息可靠。其中，Gene Ontology(GO)選取標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05、FDR<0.05，且每條注釋信息至少包含10個(gè)基因。利用REViGO[9]對符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的GO Terms進(jìn)行分類及總結(jié)。REViGO對輸入的GO Terms進(jìn)行比較，然后通過文本相似性總結(jié)出具有代表性的基因注釋信息。

1.4 數(shù)據(jù)分析平臺及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用R編程語言(https://www.r-project.org)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及實(shí)驗(yàn)結(jié)果可視化，P<0.05且FDR<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 自噬相關(guān)基因在紅細(xì)胞終末分化各階段的表達(dá)模式

在747個(gè)人體自噬相關(guān)基因中，共有726個(gè)基因在紅細(xì)胞終末分化各階段表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，去除在所有樣本中表達(dá)之和小于1的基因，共獲得可用于后續(xù)分析的自噬相關(guān)基因535個(gè)。對其在紅細(xì)胞終末分化各階段的表達(dá)概況進(jìn)行分析，其中，100個(gè)自噬相關(guān)基因在原始紅細(xì)胞及早幼紅細(xì)胞中表達(dá)較低，而在中幼紅細(xì)胞及晚幼紅細(xì)胞中表達(dá)較高(圖1，Pattern 1)；271個(gè)自噬相關(guān)基因在原始紅細(xì)胞及早幼紅細(xì)胞中表達(dá)較高，而在中幼紅細(xì)胞及晚幼紅細(xì)胞中的表達(dá)逐漸減弱(圖1，Pattern 2)；164個(gè)自噬相關(guān)基因僅在晚幼紅細(xì)胞中表達(dá)較低(圖1，Pattern 3)。同時(shí)，通過圖1左側(cè)的基因聚類分析也可得出自噬相關(guān)基因在紅細(xì)胞終末分化各階段共有3種表達(dá)模式。

2.2 表達(dá)模式Pattern 1自噬相關(guān)基因集的注釋

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對符合表達(dá)模式Pattern 1的100個(gè)自噬相關(guān)基因進(jìn)行注釋，選用默認(rèn)參數(shù)，共獲得756個(gè)GO Terms，在此基礎(chǔ)上，設(shè)置P<0.05、FDR<0.05，且每條注釋信息至少包含10個(gè)基因?yàn)楹Y選條件，最終獲得128個(gè)GO Terms。利用REViGO對符合篩選條件的GO Terms進(jìn)行總結(jié)，分析結(jié)果如圖2所示，該組基因能夠富集到細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞器解體、分子功能的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化、巨自噬、自噬、囊泡運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)過程。

2.3 表達(dá)模式Pattern 2自噬相關(guān)基因集的注釋

經(jīng)DAVID數(shù)據(jù)庫注釋，表達(dá)模式Pattern 2的自噬相關(guān)基因得到了1 189個(gè)GO Terms，篩選(標(biāo)準(zhǔn)同2.2)之后，最終獲得265個(gè)GO Terms。利用REViGO對符合篩選條件的GO Terms進(jìn)行總結(jié)，結(jié)果如圖3所示，自噬的調(diào)節(jié)、囊泡介導(dǎo)的運(yùn)輸、凋亡過程、蛋白質(zhì)磷酸化、自噬為Pattern 2主要富集的生物學(xué)過程。

圖1 人體自噬相關(guān)基因在紅細(xì)胞終末分化不同階段的表達(dá)Fig.1 Expression of human autophagy related genes in different stages of terminal erythrocyte differentiation.

圖2 表達(dá)模式Pattern 1自噬相關(guān)基因集注釋結(jié)果Fig.2 Gene ontology of Pattern 1 autophagy genes.

圖3 表達(dá)模式Pattern 2自噬相關(guān)基因集注釋結(jié)果Fig.3 Gene ontology of Pattern 2 autophagy genes.

2.4 表達(dá)模式Pattern 3自噬相關(guān)基因集的注釋

經(jīng)DAVID數(shù)據(jù)庫注釋，表達(dá)模式Pattern 3的自噬相關(guān)基因得到了188個(gè)GO Terms，篩選(標(biāo)準(zhǔn)同2.2)之后，最終僅獲得9個(gè)GO Terms。利用REViGO對符合篩選條件的GO Terms進(jìn)行總結(jié)，結(jié)果如圖4所示，Pattern 3主要富集到蛋白質(zhì)磷酸化、囊泡介導(dǎo)的運(yùn)輸、巨自噬、自噬等生物學(xué)過程。

圖4 表達(dá)模式Pattern 3自噬相關(guān)基因集注釋結(jié)果Fig.4 Gene ontology of Pattern 3 autophagy genes.

2.5 3種不同表達(dá)模式自噬相關(guān)基因集的綜合分析

為了探究3種不同表達(dá)模式的自噬相關(guān)基因集的差異，分別選取各表達(dá)模式基因富集的前10個(gè)GO Terms(表1)。通過比較可知，富集到自噬、巨自噬生物學(xué)過程中的有3種不同表達(dá)模式的基因集；而富集到線粒體解體和線粒體自噬的主要為Pattern 1基因集；Pattern 2和Pattern 3基因集富集的GO Terms相似，這也符合兩者基因表達(dá)的模式，即隨著紅細(xì)胞的逐漸成熟，兩者的基因表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(圖1)，同時(shí)自噬的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及磷酸化在兩者中有較高的富集。

表1 Pattern 1、Pattern 2、Pattern 3基因集中前10個(gè)GO TermsTable1 Top ten GO Terms of Pattern 1, Pattern 2, Pattern 3.

3 討論

1967年，Deter和De Duve[1]首次提出自噬這個(gè)概念。隨后，研究表明細(xì)胞自噬對生物體的生長發(fā)育具有重要意義[2]。紅細(xì)胞的生成是一個(gè)動態(tài)的過程，在該過程中，最明顯的變化是紅細(xì)胞形態(tài)及其內(nèi)容物的變化，因?yàn)檎３墒旒t細(xì)胞不具有細(xì)胞核、線粒體及其他細(xì)胞器，這些物質(zhì)的清除在紅細(xì)胞成熟的過程中非常重要。借助慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562，F(xiàn)ader和Colombo[10]發(fā)現(xiàn)在紅細(xì)胞成熟過程中存在著自噬現(xiàn)象。

目前，針對紅細(xì)胞終末分化發(fā)育階段自噬的研究主要集中在具體自噬基因的作用[11]，而忽略了自噬相關(guān)基因在不同發(fā)育階段的整體概況。本研究主要是利用高通量測序數(shù)據(jù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析手段，對自噬相關(guān)基因在紅細(xì)胞終末分化各階段的表達(dá)進(jìn)行研究。通過數(shù)據(jù)分析可知，自噬相關(guān)基因在人體原始紅細(xì)胞、早期早幼紅細(xì)胞、晚期早幼紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞和晚幼紅細(xì)胞5個(gè)階段的表達(dá)呈現(xiàn)出動態(tài)變化的趨勢。同時(shí)，基因聚類分析結(jié)果表明，可根據(jù)基因表達(dá)的時(shí)序，將所有自噬相關(guān)基因分為3種表達(dá)模式：Pattern 1在原始紅細(xì)胞及早幼紅細(xì)胞中表達(dá)較低，而在中幼紅細(xì)胞及晚幼紅細(xì)胞中的表達(dá)逐漸增高；Pattern 2與Pattern 1表達(dá)模式幾乎相反；Pattern 3僅在晚幼紅細(xì)胞中表達(dá)較低。

Cao等[12]通過對Atg7基因敲除小鼠的觀察發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞的分化被阻滯在原始紅細(xì)胞階段，同時(shí)在自噬信號通路被上調(diào)的WT小鼠中，晚幼紅細(xì)胞數(shù)量顯著增加。這表明Atg7在原始紅細(xì)胞中具有重要作用，同時(shí)反映了自噬與紅細(xì)胞分化緊密相關(guān)；此外，刺激自噬信號通路可以動員紅系祖細(xì)胞的增殖和分化，最終表現(xiàn)為成熟紅細(xì)胞的增加[12]。在本研究中，Atg7的表達(dá)模式屬于Pattern 2，即在原始紅細(xì)胞及早幼紅細(xì)胞中高表達(dá)，也與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[12]相似。同時(shí)，這也提示了與Atg7表達(dá)模式相同的自噬相關(guān)基因在紅細(xì)胞終末分化的早期發(fā)揮著重要作用。從圖1可以看出，有超過50%的自噬相關(guān)基因在原始紅細(xì)胞階段呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，這表明自噬在紅細(xì)胞發(fā)育的早期顯得比較重要，但并不意味著自噬在紅細(xì)胞發(fā)育的晚期不重要。

研究發(fā)現(xiàn)，unc-51樣激酶(unc-51 like kinase 1，ULK1/Atg1)基因在紅細(xì)胞成熟的最后階段具有重要作用，是線粒體自噬的關(guān)鍵基因[13]。線粒體自噬最早由Lemasters[14]提出，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)線粒體膜電位降低及線粒體內(nèi)膜電導(dǎo)率滲透過渡孔隙打開時(shí)可引起線粒體自噬。線粒體是為細(xì)胞提供能量的場所，在其供能的同時(shí)會產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS的堆積可對線粒體造成傷害，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。而自噬相關(guān)基因的缺失則會導(dǎo)致線粒體的清除障礙，進(jìn)而影響紅細(xì)胞的成熟，并最終造成貧血。Mortensena等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，Atg7-/-敲除小鼠有核紅細(xì)胞中存在受損線粒體堆積的現(xiàn)象，而這些受損線粒體能夠改變細(xì)胞膜電位，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，為了維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及細(xì)胞本身的正常增殖、分化，適時(shí)清除線粒體顯得尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)，富集到線粒體自噬相關(guān)通路的主要為表達(dá)模式Pattern 1的基因集，該基因集在紅細(xì)胞成熟的后期(即中幼紅細(xì)胞及晚幼紅細(xì)胞)呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。這種現(xiàn)象提示，在紅細(xì)胞終末分化的早期階段(原始紅細(xì)胞及早幼紅細(xì)胞)，細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及磷酸化等生理過程較為活躍，此時(shí)消耗的能量較多，線粒體也呈現(xiàn)出活躍狀態(tài)。但隨著細(xì)胞進(jìn)程的發(fā)展，蛋白質(zhì)等相關(guān)物質(zhì)的合成及積累已滿足生理活動的需要，而線粒體由于前期的活躍狀態(tài)，ROS等有害物質(zhì)的堆積較多，因此，為了保持細(xì)胞的正常狀態(tài)，線粒體自噬相關(guān)基因被啟動。

同時(shí)，正確理解線粒體自噬在紅細(xì)胞生成中的具體機(jī)制有助于紅細(xì)胞相關(guān)疾病的預(yù)防和治療[4]。盡管線粒體自噬對紅細(xì)胞的生成和行使正常的功能至關(guān)重要，但也有研究人員指出，在不同的研究模型和基因中，線粒體自噬缺失的程度對紅細(xì)胞生成的影響也是不同的[16]，因此通過比較不同研究中線粒體自噬相關(guān)的機(jī)制，并找出其共性顯得尤為重要。

本研究利用生物信息學(xué)方法對紅細(xì)胞終末分化各階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，從中提取自噬相關(guān)基因的表達(dá)。經(jīng)分析比較可知，在紅細(xì)胞終末分化的早期(即原始紅細(xì)胞、早幼紅細(xì)胞)，50%以上的自噬相關(guān)基因已經(jīng)表達(dá)，這表明早期的自噬活動對紅細(xì)胞的分化及成熟紅細(xì)胞的生成至關(guān)重要。在紅細(xì)胞終末分化的后期(即中幼紅細(xì)胞、晚幼紅細(xì)胞)，線粒體自噬相關(guān)基因的表達(dá)增高，這提示了線粒體自噬在紅細(xì)胞成熟的最后階段發(fā)揮著重要作用。綜上所述，本研究描繪了自噬相關(guān)基因在紅細(xì)胞終末分化各階段的表達(dá)呈現(xiàn)出動態(tài)變化的現(xiàn)象，并表明不同表達(dá)模式的基因集在不同階段的表達(dá)程度亦不同，基因注釋結(jié)果有利于對紅細(xì)胞生成及成熟過程的認(rèn)識，更為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供了思路。