張明英, 袁佳佳, 張曉茹, 邢 文, 白 潔, 周 圓*

1.中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院血液病醫(yī)院(血液學研究所), 實驗血液學國家重點實驗室, 天津 300020;2.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院, 天津 300020

白血病是嚴重危害人民健康的重大疾病，位列我國腫瘤死亡率的第 6 位，而且其發(fā)病率還在呈逐年攀升趨勢。關(guān)于白血病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)研究受到越來越多的關(guān)注，在研究過程中面臨著諸多問題，如懸浮的白血病細胞感染效率低、包裝慢病毒(lentivirus)價格昂貴等。包裝慢病毒常用的方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染法等。目前脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法產(chǎn)生的慢病毒滴度較高，但是包裝慢病毒成本比較高。線性聚乙烯亞胺(linear polyethylenimine，LPEI)作為非病毒類載體一直受到廣泛的關(guān)注，而且具有價格便宜、配制方便、易獲取等優(yōu)點，在包裝慢病毒時是一種非常實用的轉(zhuǎn)染試劑，被認為可以作為轉(zhuǎn)染試劑在一定程度上解決這些問題，但是利用其包裝的慢病毒顆粒對懸浮的白血病細胞感染效率如何，對細胞增殖、分化等生物學特性有怎樣的影響，一直未見明確報道。本實驗通過分別用線性聚乙烯亞胺(linear polyethylenimine，LPEI)和脂質(zhì)體-Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將攜帶SFFV啟動子和增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)標簽蛋白的慢病毒載體包裝成慢病毒顆粒，通過比較兩種轉(zhuǎn)染試劑對慢病毒包裝效率、病毒包裝后感染白血病細胞系的能力以及感染白血病細胞系后對細胞的毒性作用，為今后LPEI轉(zhuǎn)染試劑包裝慢病毒在白血病研究中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

細胞培養(yǎng)基Dulbecco’s modification of Eagle medium(DMEM)、RPMI1640、Opti-MEM(減血清培養(yǎng)基)、脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)、CellTrace CFSE細胞增殖試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)購自以色列Biological Industries公司；LPEI購自美國Alfa Aesar公司；Polybrene、全反式維甲酸購自美國 Sigma-Aldrich公司；Cell Counting Kit-8(CCK8)購自日本Dojindo公司；流式細胞儀Canto II購自美國Becton Dickinson公司；熒光倒置顯微鏡TE2000-S購自日本Nikon公司；高速離心機(型號Avavti J-26 XP)購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 質(zhì)粒

包裝載體psPAX2、pCMV-VSV-G由英國帝國理工學院Ernesto Yague博士惠贈。慢病毒載體SFFV-eGFP由蘇州泓迅生物科技有限公司構(gòu)建。

1.3 細胞株及培養(yǎng)條件

K562、HL60、HEL、293T細胞均購自ATCC細胞庫，由本所細胞庫保存。K562、HL60、HEL細胞懸浮培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，293T細胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中。細胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天離心換液，293T細胞在70%～90%融合后經(jīng)0.125%胰蛋白酶消化后傳代。

1.4 慢病毒包裝

1.4.1配制LPEI溶液 首先配制HBS, 稱取2.19 g NaCl溶于ddH2O中，用HEPES和1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.4，定容至250 mL后，過0.2 μm濾膜后放4℃儲存?zhèn)溆?。稱量LPEI粉末0.05 mg溶于配好的50 mL HBS中(終濃度為1mg/L)，室溫搖床過夜后觀察LPEI粉末完全溶解后過0.2 μm濾膜，分裝儲存在4℃冰箱。

1.4.2用LPEI或脂質(zhì)體包裝慢病毒 LPEI轉(zhuǎn)染法如圖1所示：①45 μL LPEI(1 mg/μL)+900 μL DMEM培養(yǎng)基室溫靜置5 min；②15 μg質(zhì)粒(慢病毒質(zhì)粒10 μg；psPAX2 4 μg；pCMV-VSV-G 1 μg)+ 900 μL DMEM培養(yǎng)基，將①逐滴加入②中(LPEI加入質(zhì)?；旌衔镏?，室溫靜置20 min。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法如圖1所示：①30 μL Lipo2000+500 μL OPTI-MEM室溫靜置5 min；②15 μg質(zhì)粒(慢病毒質(zhì)粒10 μg； psPAX2 4 μg；pCMV-VSV-G 1 μg)+500 μL OPTI-MEM，將②逐滴加入①中(質(zhì)粒混合物加入Lipo2000中)，室溫靜置10～20 min。

取對數(shù)生長期的293T細胞，按每皿1×107細胞接種一個10cm2培養(yǎng)皿，待細胞匯合至70%～90%，將培養(yǎng)皿中的細胞培養(yǎng)液換成4 mL含有新鮮10%FBS的DMEM。將PEI/脂質(zhì)體與質(zhì)粒的混合液逐滴、緩慢加入10 cm皿中，輕輕晃動混勻，37℃ 5% CO2溫箱培養(yǎng)。培養(yǎng)6～8 h后換5 mL新鮮的DMEM/10%FBS。

1.4.3慢病毒濃縮 分別于48 h、72 h收集病毒于離心管中，將收集的48 h、72 h病毒上清合并，2 000 r/min離心10 min去除細胞碎片，上清經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾到病毒超離管中，4℃ 20 000 r/min高速離心2.5 h。將濃縮后的病毒分裝至EP管中放置-80℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 脂質(zhì)體和LPEI轉(zhuǎn)染方法實驗流程圖Fig.1 Flow chart of liposome and LPEI transfection method.

1.5 病毒滴度測定

提前一天將293T細胞按每個孔1×106細胞接種于六孔板中，20～24 h左右觀察匯合度在70%～90%。按濃縮病毒原液及1∶10、1∶100、1∶1 000的方案對病毒進行稀釋，將不同濃度的病毒加入293T細胞。感染后48 h收集細胞，用流式細胞儀檢測GFP陽性率。選取熒光比例10%～20%的孔，按如下公式進行滴度計算：病毒滴度(TU/mL)=感染時293T細胞數(shù)×GFP陽性細胞% ×稀釋倍數(shù)/加入病毒體積(mL)來測定LPEI和脂質(zhì)體兩種轉(zhuǎn)染方法包裝得到的慢病毒滴度。

1.6 慢病毒感染白血病細胞

取對數(shù)生長的K562、HL60和HEL細胞加入24孔細胞培養(yǎng)板中(1×105/孔)。根據(jù)MOI值(K562=20～40，HL60=100，HEL=1～10)計算加入病毒體積(感染細胞數(shù)×被感染細胞MOI值/濃縮后慢病毒滴度)，最后用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液定容至500 μL/孔[1～3]。將24孔板配平后，1 800 r/min，33℃,離心90 min，8 h后換液。第二天用相同方法做二次感染。感染48 h后，收集細胞用PBS洗去慢病毒和培養(yǎng)液，通過流式細胞儀檢測能夠表達增強型綠色熒光蛋白(EGFP)細胞的陽性率，比較兩種轉(zhuǎn)染方法包裝的慢病毒對白血病細胞感染效率的影響。

1.7 細胞生物學特性觀察

1.7.1細胞增殖檢測 ①生長曲線繪制。用含10% FBS 的培養(yǎng)基將待測細胞配成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為 2×104/mL，每孔體積為 100 μL，接種到 96 孔板。每種細胞設(shè)置3個平行孔。分別在培養(yǎng)后不同時間點(0 d、1 d、2 d、3 d、4 d)每孔加入CCK-8溶液10 μL檢測生長情況。37℃繼續(xù)孵育 4 h后，在450 nm 波長測定各孔光吸收值(OD 值)，記錄結(jié)果。所有時間點吸光度值與 0 h比較，繪制細胞生長曲線[4～7]。

②CFSE標記細胞增殖。取出1×106細胞重懸在 1 mL PBS 里，另取 1×105細胞，PBS 洗1次，2% PFA 固定，作為陰性管。每 1 mL 細胞液(1×106)加入 1 μL CFSE染色液(5 mmol/L)，立即渦旋。37℃，避光孵育 20 min，中間渦旋一次。加入5倍細胞液體積的至少含 1%蛋白(血清)的培養(yǎng)基中止染色，靜置 5 min。4℃，300 g 離心 5 min，重復 2 次。用預熱的完全培養(yǎng)基重懸細胞，取出 3×105細胞，PBS 洗一次，2% PFA固定。剩余細胞 37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中不同時間點取出 3×105細胞，PBS 洗一次，2% PFA 固定，待所有時間點取完后一同進行流式檢測[8]。

1.7.2細胞分化測定 取未感染的HL60細胞和LPEI及脂質(zhì)體方法包裝的慢病毒感染的HL60細胞分別接種于6孔板中，每孔接種2×105/mL，加入1 mmol/L全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)5 μL對細胞進行誘導分化。分別于2 d后用抗人CD11b抗體標記，流式細胞儀檢測細胞的分化情況[9～11]。

1.7.3細胞系克隆形成(colony formation cells,CFC)實驗 對感染后細胞系計數(shù)，并調(diào)整細胞懸液濃度至1.5×104/mL，制備成 10×細胞懸液。分別取 100 μL，加至 1.6 mL H4230 甲基纖維素中，使最終每孔細胞數(shù)為500個。震蕩混勻，4℃靜置20 min至氣泡升至液面上部。用1 mL注射器將混勻的細胞加入24孔板中，每孔0.5 mL，3個重復孔。14 d后計數(shù)CFC集落類型和數(shù)目，并用 0.05%甲紫染色，PBS洗滌，掃描儀掃描。

1.8 統(tǒng)計分析

利用 GraphPad Prism 7.0 對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和作圖。Unpairedt-test用于兩組之間比較。實驗數(shù)據(jù)以均值±標準誤(Mean±SEM)表示，P<0.05 被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢病毒制備和滴度測定

用LPEI和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法在293T細胞中將SFFV-eGFP慢病毒質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒包裝成慢病毒，收集病毒并分別進行濃縮，293T細胞經(jīng)兩種方法介導進行慢病毒包裝時GFP表達情況如圖2A所示。在293T細胞中，依次加入按梯度稀釋的濃縮后慢病毒，流式細胞儀分析顯示脂質(zhì)體組加入1×、1∶10、1∶100、1∶1 000梯度稀釋的慢病毒后細胞的eGFP陽性率分別為47.7%、10.4%、3.91%、2.68%，而LPEI組經(jīng)同樣梯度稀釋的慢病毒感染后細胞eGFP陽性率分別為48.2%、12.9%、4.39%、3.05%(圖2B,C)，LPEI組eGFP陽性率略高。選取熒光比例10%～20%的孔計算病毒滴度(1∶10稀釋組)，根據(jù)濃縮倍數(shù)換算，得到濃縮前等量慢病毒載體經(jīng)LPEI和脂質(zhì)體方法包裝后的病毒滴度分別為4.7×107TU/mL和 4.1×107TU/mL。由此說明，與脂質(zhì)體組相比，LPEI組包裝出的病毒滴度略高。

圖2 脂質(zhì)體和LPEI轉(zhuǎn)染方法檢測慢病毒滴度Fig.2 Titer detecting of lentivirus with liposome and LPEI transfection method.注：A：熒光顯微鏡下，293T細胞包被慢病毒時GFP的表達情況；B、C：不同濃度濃縮后慢病毒 (1×, 1∶10, 1∶100, 1∶1 000) 感染293T細胞后，流式細胞儀檢測GFP+的表達，以計算慢病毒滴度。

2.2 慢病毒感染白血病細胞系的效率

取對數(shù)生長期的K562、HL60和HEL細胞加入細胞培養(yǎng)板中，在同一細胞中加入等量的經(jīng)LPEI或者脂質(zhì)體包裝出的慢病毒顆粒(不同細胞所需病毒總量根據(jù)MOI值計算)。取感染48 h后細胞，以未感染慢病毒的白血病細胞為對照，通過流式細胞儀檢測eGFP陽性率，比較兩種轉(zhuǎn)染方法包裝產(chǎn)生的慢病毒感染白血病細胞的效率。結(jié)果顯示K562-LPEI和K562-脂質(zhì)體組的GFP陽性率分別為99.3%和99.6%；HL60-LPEI和HL60-脂質(zhì)體組的GFP陽性率分別為99.7%和99.7%；HEL-LPEI和HEL-脂質(zhì)體組的GFP陽性率分別為99.8%和99.8%。結(jié)果表明兩種轉(zhuǎn)染試劑包裝后的慢病毒顆粒均能成功進入白血病細胞中，脂質(zhì)體方法和LPEI方法包被出的病毒在感染白血病細胞系時，兩組間的感染效率無明顯差別(圖3)。

2.3 不同轉(zhuǎn)染方法包裝慢病毒對感染后白血病細胞增殖的影響

為了驗證LPEI和脂質(zhì)體兩種轉(zhuǎn)染方法包裝得到的慢病毒是否對目的細胞生物學特性產(chǎn)生影響，我們利用CCK-8和CFSE染色兩種方法研究對比了經(jīng)兩種病毒感染后白血病細胞的增殖情況。流式結(jié)果圖擬合CFSE結(jié)果顯示，經(jīng)兩種方法包裝的病毒感染的K562、HL60和HEL細胞加入CFSE 4 d后增殖集中在第6代(parent 6，P6)和第7代(parent 7，P7)，并將1～4天的增殖指數(shù)(proliferation index)進行統(tǒng)計學分析，用來比較脂質(zhì)體組和LPEI組間增殖的差異(圖4A)。綜合CFSE法和CCK-8法結(jié)果顯示：在K562細胞中，無論是CCK-8法還是CFSE法，兩種轉(zhuǎn)染方法包裝的慢病毒對其增殖能力無顯著影響。同樣在HL60細胞中，CCK-8結(jié)果顯示兩組間的增殖能力無顯著差異，但CFSE法顯示，經(jīng)LPEI包裝的慢病毒對HL60細胞增殖的影響比脂質(zhì)體法更為明顯(P<0.001)。此外，在HEL細胞中，CCK-8法顯示，經(jīng)LPEI包裝的慢病毒對HEL細胞增殖的影響比脂質(zhì)體法更為明顯(P<0.05)，CFSE實驗也有類似的趨勢，但是兩組之間沒有達到顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05) (圖4)。結(jié)果表明，在一部分白血病細胞中，與脂質(zhì)體包裝慢病毒方法相比，LPEI包裝慢病毒方法包裝的慢病毒感染后細胞的增殖能力稍有減慢。

圖3 用相同脂質(zhì)體和LPEI包被的慢病毒顆粒感染人白血病細胞系(K562、HL60、HEL)后陽性率比較Fig.3 Detection of GFP+leukemic cells(K562,HL60,HEL)after infection with same amount of virus particles packaged with LPEI or liposomes,respectively.

圖4 脂質(zhì)體和LPEI包被的慢病毒感染人白血病細胞系后對白血病細胞系(K562、HL60、HEL)增殖的影響Fig.4 Comparison of proliferation of leukemic cells(K562,HL60,HEL)infected with lentiviruses packaged with liposomes and LPEI.注：A：利用CFSE分別標記 K562、HL60和HEL細胞增殖。B：利用CCK8方法繪制 K562、HL60和HEL細胞的生長曲線。*，***分別表示在P<0.05與P<0.001水平差異顯著。NS:差異不顯著。

2.4 不同轉(zhuǎn)染方法包裝慢病毒對感染后白血病細胞分化和克隆形成能力的影響

HL60細胞為人急性早幼粒細胞模型，容易被ATRA誘導分化。為了對比兩種轉(zhuǎn)染方法對白血病細胞誘導分化能力的影響，我們將感染后并穩(wěn)定增殖的HL60細胞分別用ATRA誘導2 d后，通過抗CD11b抗體標記，觀察細胞分化情況。結(jié)果表明，未感染病毒的對照組CD11b陽性率為33%，脂質(zhì)體組和LPEI組CD11b陽性率分別為31.9%和30% (圖5A)，所以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法和LPEI轉(zhuǎn)染方法都不影響HL60細胞的分化?？寺⌒纬赡芰捎脕碓u估群體細胞中有增殖潛力的單個細胞的頻率，為了進一步比較兩種轉(zhuǎn)染方法對細胞生物學特性的影響，我們繼而對感染后的HL60細胞做了克隆形成實驗，結(jié)果顯示，未感染病毒的對照組、脂質(zhì)體組和LPEI兩組的克隆形成基本數(shù)量相同，3組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖5B)。

3 討論

隨著白血病研究的深入開展，將外源基因片段通過慢病毒介導的方法導入白血病細胞，建立穩(wěn)定表達細胞株的研究是非常普遍的。由于白血病細胞的懸浮特性和較高的MOI值，包被高滴度病毒并且達到較高的感染效率是白血病研究中的關(guān)鍵步驟。慢病毒載體是以HIV-1(人類免疫缺陷病毒Ⅰ型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，包裝后的慢病毒可以將外源基因有效整合到宿主細胞染色體而實現(xiàn)長時間穩(wěn)定表達，而且對分裂細胞和非分裂細胞尤其是難感染細胞均有很好的感染能力[12]。包裝慢病毒除了需要目的質(zhì)粒和輔助包裝質(zhì)粒以外，還需要借助轉(zhuǎn)染試劑為產(chǎn)生病毒顆粒提供輔助作用。為獲得滿意的轉(zhuǎn)染效果，選擇高效、安全、低成本的轉(zhuǎn)染試劑進行研究顯得尤為重要。

圖5 脂質(zhì)體和LPEI包被的慢病毒感染人白血病細胞系后對白血病細胞系HL60分化的影響Fig.5 Detection of ATRA-induced differentiation ability and colony formation ability of HL60 cells infected with lentiviruses packaged with liposomes or LPEI.注：A：流式細胞儀分別檢測脂質(zhì)體組和LPEI組HL60細胞經(jīng)ATRA誘導后CD11b的表達；B：脂質(zhì)體組和LPEI組HL60細胞的克隆形成細胞數(shù)和甲紫染色后的結(jié)果。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑是一種多用途且高效的轉(zhuǎn)染試劑，應(yīng)用于所有常見細胞系及許多難以轉(zhuǎn)染的細胞系。脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將質(zhì)粒包裹入內(nèi)，進而被表面帶負電荷的細胞膜吸附，介導DNA-脂質(zhì)體復合物進入細胞質(zhì)，再進一步進入細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達。PEI是一種陽離子聚合物，一個重要特征是高濃度的帶正電荷的氮原子促進帶負電的DNA的有效結(jié)合和縮合[13～15]。PEI作為一種被廣泛研究的基因遞送非病毒載體，在不同細胞和轉(zhuǎn)染條件下展現(xiàn)出穩(wěn)定高效的基因轉(zhuǎn)染效果[16～19]。有研究報道，相比于其他結(jié)構(gòu)的PEI,線性PEI(LPEI)在基因治療中表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率[20]。有報道指出，在293T細胞(人胚腎上皮細胞)中，調(diào)整質(zhì)粒和PEI質(zhì)量比，PEI轉(zhuǎn)染效率可以和脂質(zhì)體相當甚至超過脂質(zhì)體[21]。但PEI也被報道瞬轉(zhuǎn)后能阻止人乳頭瘤病毒和人巨細胞病毒感染與細胞的粘附，降低感染效率[22]。

本實驗中采用psPAX2和pCMV-VSV-G為包裝質(zhì)粒的三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝慢病毒，構(gòu)建了能夠在造血細胞中高效啟動基因表達的SFFV啟動子代替常用的CMV啟動子構(gòu)建慢病毒載體，下游eGFP基因以觀察細胞的感染效率[23]。本研究分別用LPEI和脂質(zhì)體兩種方法將SFFV-eGFP慢病毒載體包裝成慢病毒，結(jié)果與以往報道類似，LPEI介導的慢病毒包裝得到的滴度略高。進而，白血病細胞系的感染實驗顯示，兩種包裝方法得到的慢病毒對細胞感染效率無差異，在多種白血病細胞中感染效率均能達到98%以上。白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病，具有過度增殖和分化阻滯特征。我們的實驗結(jié)果顯示，在一部分細胞中，LPEI組的細胞增殖較脂質(zhì)體組略有減弱。對于感染慢病毒后HL60細胞的分化和克隆形成能力，脂質(zhì)體和LPEI組差異不明顯，但是有待在更多白血病細胞中進行驗證?？傊?，與脂質(zhì)體相比，LPEI作為轉(zhuǎn)染試劑包裝的慢病毒對某些白血病細胞的增殖略有影響，但是對分化和克隆形成影響不大。鑒于實驗中還會存在利用同一感染方法包裝的攜帶外源基因的載體以及對照載體，因此，LPEI可以作為一種轉(zhuǎn)染試劑用于包裝轉(zhuǎn)染白血病細胞的慢病毒載體，其包裝出的慢病毒用于轉(zhuǎn)染具有廣泛、高效及穩(wěn)定等特性。LPEI的應(yīng)用對于可以大大降低包裝慢病毒的成本，可替代目前廣泛應(yīng)用的脂質(zhì)體用于白血病研究中。