陳芳 劉琴 王麗平 陳利鋒 張宜 楊鴻*

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性自身性免疫性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，在治療方面亦無特效治療措施[1]。全球有0.5%～1%的人群受到此疾病的影響，該病不僅致殘率高，還可引起血管炎、心包炎等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，造成巨大的家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)[2]。尋找安全、有效緩解RA 病情的藥物是目前治療RA 的重點(diǎn)[3]。佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）動(dòng)物模型已經(jīng)廣泛用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的研究和評(píng)估潛在的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物的臨床應(yīng)用[4]。而從報(bào)道文獻(xiàn)來看，兔RA 動(dòng)物模型普遍存在標(biāo)準(zhǔn)不一、流程各異和細(xì)節(jié)不清的問題，特別是檢測(cè)指標(biāo)不統(tǒng)一等，甚至只是從肉眼來判斷，諸多設(shè)計(jì)思路也值得商榷。如何復(fù)制出更接近RA 的動(dòng)物病理模型一直成為困擾風(fēng)濕免疫科研工作者的難題，因此尋找發(fā)病機(jī)制更接近RA 的動(dòng)物模型具有重要的臨床意義[5]。本研究旨在建立一個(gè)較完整的兔佐劑性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，為研究關(guān)節(jié)疾病的發(fā)病機(jī)制、病理變化以及藥物療效、作用機(jī)制提供一個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新西蘭大白兔16 只，雌雄不限，體質(zhì)量2.5 ～3.0 kg，清潔級(jí)，由武漢市新洲區(qū)萬千佳禾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供[SCXK(鄂)2017-0045]，本實(shí)驗(yàn)在廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行[SYXK(鄂)2014-0082]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（中國(guó)人民解放軍武漢總醫(yī)院）倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行[武總動(dòng)(福)第2018038 號(hào)]。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

弗式完全佐劑（Sigma 公司，美國(guó)）；蘇木素、伊紅Y（水溶性）、無水乙醇、二甲苯、鹽酸、包埋石蠟、中性樹脂等由國(guó)藥集團(tuán)提供；脫鈣液（硝酸-甲醛液，按甲醛15 mL，蒸餾水90 mL，純硝酸20 mL 比例來配制），硝酸和甲醛由武漢市潔洋盛科技公司提供；病理切片機(jī)（Leica RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，德國(guó)），組織攤烤片機(jī)（武漢俊杰JK-6 生物組織攤烤片機(jī)），顯微鏡（尼康E100 型生物顯微鏡），倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯，日本），軟皮尺等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 AA 兔模型的建立[6]

新西蘭兔16 只，1 只/籠進(jìn)行分籠喂養(yǎng)，隨機(jī)分組為正常組（8 只）和模型組（8 只），飼養(yǎng)間溫度18 ～24℃，相對(duì)濕度40%～60%。新西蘭兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，足爪剃毛稱體重，測(cè)足趾部的周徑。模型組初次誘導(dǎo)：將家兔背部肩胛骨間及雙膝關(guān)節(jié)以下的毛用脫毛劑脫去，每只新西蘭兔右跖部皮下注射弗氏完全佐劑0.4 mL，同時(shí)注射背部4 點(diǎn)，每點(diǎn)0.2 mL。加強(qiáng)誘導(dǎo)：注射后7 d 加強(qiáng)注射弗式完全佐劑1 次，每只新西蘭兔右跖部皮下注射弗氏完全佐劑0.4 mL；背部任意2 點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.2 mL。

1.3.2 AA 兔模型的鑒定

1.3.2.1 雙側(cè)足趾周徑測(cè)定

采用軟皮尺于造模前、造模后24 d 分別測(cè)定各組家兔雙足跖周徑變化。測(cè)量時(shí)注意取相同松緊度，于足趾腫脹最高點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量。

1.3.2.2 兔雙足X 線片變化

隨機(jī)抽取正常組和模型組兔各3 只，于我院放射科行雙足斜位X 線片。并對(duì)其足趾軟組織腫脹度、關(guān)節(jié)變化情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.2.3 滑膜組織HE 染色

在取材之前對(duì)兔肉眼所見拍照，并在取材過程中拍下一些典型的病變特征。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫臼處死，取踝關(guān)節(jié)，修剪整齊后，放入10%的甲醛固定液中，固定1 周后，轉(zhuǎn)入甲酸脫鈣液中，脫鈣至骨質(zhì)變軟，用小刀切取軟骨，修剪成0.5 cm×0.4 cm×0.3 cm，并包埋（梯度乙醇脫水、二甲苯脫水、透明，石蠟包埋切片，分別用蘇木精-伊紅染色）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AA 兔足趾周長(zhǎng)的影響

表1 結(jié)果顯示，造模前，各組間右足趾周長(zhǎng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），造模各組右足趾周長(zhǎng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性；造模組足趾周長(zhǎng)均較正常組明顯升高（P＜0.05）。

表1 各組實(shí)驗(yàn)兔致炎側(cè)足趾周長(zhǎng)比較

表1 各組實(shí)驗(yàn)兔致炎側(cè)足趾周長(zhǎng)比較

注：*與正常組比較＜0.05。

組別 n(只） 致炎側(cè)足趾周長(zhǎng)（cm）造模前 造模后正常組 8 5.98±0.14 6.08±0.08模型組 8 5.92±0.12 7.96±0.45*

2.2 AA 兔X 線片表現(xiàn)的影響

X 線片結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組AA 兔軟組織腫脹明顯，關(guān)節(jié)間隙變窄甚則模糊，骨皮質(zhì)變?。ㄒ妶D1）。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)兔雙足X 線片：A.正常組；B.模型組

2.3 AA 兔足關(guān)節(jié)外部觀察及HE 染色結(jié)果

新西蘭兔造模24 d 后，外部觀察足關(guān)節(jié)及足趾部明顯腫脹變形（見圖2A、圖2B），解剖可見踝關(guān)節(jié)腔有明顯的積液（見圖2C、圖2D）,解剖可見模型兔足趾部有明顯微血管增生和炎癥（見圖2E、圖2F）；滑膜組織切片HE 染色顯示，正常組的滑膜細(xì)胞呈現(xiàn)“串珠樣”規(guī)則排列（見圖3A），而模型組的滑膜細(xì)胞排列紊亂，而且還出現(xiàn)細(xì)胞水腫現(xiàn)象（見圖3B），模型組的滑膜層出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞和多核巨噬細(xì)胞（見圖3D）而正常組無炎性細(xì)胞（見圖3C），提示AA 兔模型制備成功。

圖2 新西蘭兔的足爪、關(guān)節(jié)腔及足關(guān)節(jié)的病變特征：A.正常組足；B.模型組足；C.正常組足關(guān)節(jié)；D.模型組足關(guān)節(jié)；E.正常組爪解剖面；F.模型組爪解剖面

圖3 新西蘭兔足關(guān)節(jié)滑膜組織HE 染色：A.正常組滑膜組織HE 染色呈現(xiàn)“串珠樣”規(guī)則排列（×200）；B.模型組滑膜組織HE染色出現(xiàn)細(xì)胞水腫現(xiàn)象（×200）；C.正常組滑膜組織HE 染色無炎性細(xì)胞（×200）；D.模型組滑膜組織HE 染色，滑膜層出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞和多核巨噬細(xì)胞（×200）

3 討論

雖然目前對(duì)RA 的研究已經(jīng)深入到細(xì)胞水平、分子水平以及基因水平，但RA 的病因和發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，為醫(yī)學(xué)上仍未解決的難題[7]。其臨床表現(xiàn)為對(duì)稱性的多關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，最終可造成關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞、功能障礙，甚至致殘[8]。據(jù)臨床觀察，RA 的主要病理特征為：關(guān)節(jié)滑膜炎，滑膜組織增生以及對(duì)骨和軟骨的結(jié)構(gòu)性損傷。RA 的病理過程主要是關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞及浸潤(rùn)和滑膜細(xì)胞增殖和侵襲，形成侵襲性血管翳，導(dǎo)致骨和軟骨破壞[9]。動(dòng)物模型是研究RA 的發(fā)病機(jī)制和藥效學(xué)的重要手段之一。常用于制備模型的動(dòng)物主要是大鼠，其次是兔，但是由于小動(dòng)物在生理學(xué)和免疫學(xué)方面與人類有很大的不同，相比大鼠關(guān)節(jié)炎模型，弗氏完全佐劑（complete Freund's adjuvan，CFA）誘導(dǎo)的兔關(guān)節(jié)炎模型在病理變化方面更接近人[10-11]，這就使得探索建立大動(dòng)物模型變得尤為必要。AA 兔模型又稱弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎兔模型，是一種使用廣泛的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，可用于預(yù)測(cè)多種藥物對(duì)RA 的臨床療效。早期動(dòng)物的炎癥反應(yīng)的部位常出現(xiàn)在四肢并不斷加重，活動(dòng)不便，尾部潰爛，出現(xiàn)類風(fēng)濕結(jié)節(jié)，體重下降，特別是繼發(fā)性自身免疫性腫脹，這些表現(xiàn)與人的RA 表現(xiàn)相似。AA 兔模型是RA 的經(jīng)典模型，已較為成熟，與人的病理過程十分的相似。本研究中將兔作為研究對(duì)象，采用多次多點(diǎn)于新西蘭兔右跖部皮下注射CFA 誘導(dǎo)AA 兔模型，造模3 周后，外部觀察足關(guān)節(jié)及足趾部明顯腫脹，嚴(yán)重致跛行，解剖可見模型兔足趾部有明顯微血管增生和炎癥，滑膜組織切片HE 染色顯示，正常組的滑膜細(xì)胞呈現(xiàn)“串珠樣”規(guī)則排列，而模型組的滑膜細(xì)胞排列紊亂并出現(xiàn)水腫，這些表現(xiàn)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相符。

成功的AA 動(dòng)物模型除了在病理學(xué)上與臨床一致，同時(shí)需要具備操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性等特點(diǎn)，并且用于造模的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑易購(gòu)買等[12]。本研究旨在尋求一種較為穩(wěn)定的AA 兔模型制作體系，只有規(guī)范了動(dòng)物模型，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究才具有科學(xué)性。因此筆者在實(shí)驗(yàn)過程中體會(huì)到AA 兔模型的規(guī)范化需要做大量工作。一是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量和倫理的程序化要求。應(yīng)重視實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)及單位倫理審核號(hào)。二是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的科學(xué)性要求。皮下注射CFA 的量及時(shí)間都應(yīng)慎重，在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)CFA 的量少，造模不成功，量多導(dǎo)致兔狀態(tài)極差，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展，發(fā)現(xiàn)皮下注射CFA 后，前1 周有一個(gè)急性期，而加強(qiáng)1 周后趨于穩(wěn)定。脫鈣是骨組織制片中的重要步驟，也是病理技術(shù)難點(diǎn)，而脫鈣劑的選擇十分重要。關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)既包含致密的骨組織，又包含周圍的肌肉、韌帶等軟組織，因此對(duì)其病理制片前期處理的要求更高，即要充分脫鈣又不能損傷軟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)[13-14]。在取材脫鈣的過程中，脫鈣液的配制以及脫鈣時(shí)間也需要去探索，室溫越高作用效果越明顯，也就是夏天的脫鈣效果比冬天脫鈣效果好，否則脫鈣不完全或脫鈣太過，會(huì)對(duì)切片造成影響。三是有效性指標(biāo)的要求。在實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)一個(gè)模型的建立是否成功，應(yīng)該由病理特征為依據(jù)，而不是通過肉眼觀察，前期實(shí)驗(yàn)過程中，很容易被急性期迷惑。病理特征為依據(jù)應(yīng)當(dāng)與臨床類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病變特征相結(jié)合來考慮，這樣建立的模型才能更好地為臨床中西藥研究服務(wù)。