伍林濤 奉 斌 蔡 菁

(1.成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 成都 611130； 2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院， 成都 610064；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油菜研究所， 貴陽 550008； 4.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料研究所， 貴陽 550006)

隨著全球變暖，極端氣候事件發(fā)生日趨頻繁，尤其是高溫干旱等極端氣候事件，近幾十年在我國發(fā)生的頻率和強(qiáng)度增加異常顯著[1]。高溫、干旱等非生物脅迫會引起植物的形態(tài)、生化、生理和分子等方面發(fā)生變化，并導(dǎo)致植物的產(chǎn)量下降[2-4]，對農(nóng)業(yè)造成的損害在世界范圍內(nèi)都非常廣泛。

植物在脅迫條件下，能夠感知并傳導(dǎo)逆境信號，啟動相關(guān)基因的表達(dá)，從而激活相應(yīng)的保護(hù)代謝途徑，如氣孔關(guān)閉、脫落酸(ABA)含量增加、抗氧化酶含量改變等?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)很多在脅迫應(yīng)答信號中起作用的基因，一般按功能分為兩類：一類是功能蛋白，包括糖轉(zhuǎn)運(yùn)子、水通道蛋白、抗凍蛋白和分子伴侶等，能夠直接提高植物的抗逆能力；另一類是調(diào)節(jié)蛋白，包括不同家族的轉(zhuǎn)錄因子、磷酸酶、蛋白激酶和E 3泛素連接酶等，主要參與調(diào)控脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及與脅迫相關(guān)基因的表達(dá)[5-6]。而對調(diào)節(jié)蛋白的研究，以轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控居多[7]，至于翻譯后水平調(diào)控(主要包括磷酸化和泛素化修飾)機(jī)制研究得還不透徹，是目前植物應(yīng)對脅迫調(diào)控機(jī)制研究的熱點內(nèi)容。其中泛素化修飾參與調(diào)控細(xì)胞生命活動的各個生理代謝過程，在細(xì)胞生命活動中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，特別在植物響應(yīng)外界非生物脅迫的過程是不可缺少的，因此近年來引起了越來越廣泛的關(guān)注[8-9]。

泛素依賴的蛋白酶體途徑由泛素激活酶E 1、泛素結(jié)合酶E 2和泛素連接酶E 3順序催化完成，目前，已發(fā)現(xiàn)了一些泛素E 3連接酶能夠決定靶蛋白的特異性識別，參與植物的逆境脅迫，在泛素途徑中具有重要作用[10-12]。篩選與鑒定擬南芥中與高溫、干旱相關(guān)的E 3連接酶，分析其抗逆機(jī)制，將有助于通過基因工程手段選育耐熱耐旱的植物新品種，提高高溫干旱地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力，具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究對擬南芥中具有鋅指(RING-finger)結(jié)構(gòu)，可能具有E 3泛素酶活性，并在耐熱方面起有一定作用的AT 5 g 47610進(jìn)行了基因克隆及表達(dá)分析，為進(jìn)一步鑒定其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1植物材料

野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana) Columbia (Col.)生態(tài)型為本實驗室保存。

1.1.2菌株、載體

菌株：E.coliJM 109，用于AT5G47610基因載體的構(gòu)建及克??；E.coliBL 21：用于原核表達(dá)。均為本實驗室保存。載體：PET 32 a，為本實驗室保存。

1.1.3化學(xué)及分子生物學(xué)試劑

高保真Pfu DNA多聚酶、dNTP混合物、限制性內(nèi)切酶(Bam H 1、Sac 1)均購自Fermentas(MBI)公司；T 4 DNA 連接酶、2 000 bp DNA Ladder Marker購自Takara公司；DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自Tiangen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1引物設(shè)計

根據(jù)在NCBI上查到的AT 5 G 47610的cDNA序列，使用primer 5.0設(shè)計引物。引物序列為：

UP:5’CGGGATCCAAGATGCGTTTGCTAGTAGCAG 3’

down:5’CGAGCTCGTGGCTTGAAGGAGTTTCAGAGT 3’

1.2.2RNA提取及反轉(zhuǎn)錄為cDNA

參照張年輝[13]的方法稍作改動提取擬南芥總RNA，利用RT-PCR制備擬南芥cDNA，反應(yīng)體系(20μL)：

反應(yīng)體系反應(yīng)體積/μL5×RT buffer4dNTP2Super RI0.5RT-Enhancer0.5Random Primer1Oligo dT1模板(RNA)4Rever Ace1ddH2O6

反應(yīng)程序：30 ℃，10 min;42 ℃，30 min;99 ℃，5 min;4 ℃，5 min。

1.2.3AT 5 G 47610基因的擴(kuò)增和純化

以擬南芥cDNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系(25μL)：

反應(yīng)體系反應(yīng)體積/μL10×pfu Buffer(含MgSO4)2 .5dNTP2Up Primer1Dn Primer1模板(cDNA)2Taq 酶(5U·μL-1)0.5ddH2O16

PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃變性2 min；然后進(jìn)行31個PCR循環(huán)(94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s)；最后繼續(xù)在72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2% 瓊脂糖凝膠電泳，5 V·cm-1電泳18 min后，放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察是否有目標(biāo)條帶。

按上述已摸索好的反應(yīng)條件配制10組相同的PCR體系，擴(kuò)增后將10組合為一管用于后續(xù)的純化。配制大孔的2%瓊脂糖凝膠用于膠回收。從瓊脂糖凝膠上切下含目的基因片段的凝膠，按照Tiangen公司通用型DNA純化回收試劑盒(Universal DNA Purification Kit)操作步驟純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4載體片段連接體系的構(gòu)建

AT5G47610基因的克隆以PET 32 a克隆載體進(jìn)行。將載體PET 32 a進(jìn)行Bam H 1 和Sac 1雙酶切，與AT5G47610基因酶切片段進(jìn)行連接。使用T 4 DNA連接酶的連接體系(10μL)為：

反應(yīng)體系反應(yīng)體積/μL10×Buffer1雙酶切純化AT5G47610基因片段2雙酶切PET32載體片段4T4 DNA連接酶1ddH2O2

16 ℃水浴過夜16 h。

1.2.5連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

1) 自-80 ℃中取出感受態(tài)細(xì)胞JM 109，放置于冰上至完全溶解。

2) 取5μLAT5G47610基因片段與PET 32 a的連接產(chǎn)物與50μL感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴30 min。

3) 42 ℃熱沖擊45 s，冰浴靜置5 min。

4) 加入800μL LB，37 ℃緩慢振搖1 h。

5) 5 000 r·min-1離心5 min，吸去部分上清，余下50μL上清懸浮菌體，涂布于含50μg·mL-1Amp的LB固體平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)18 h。

1.2.6表達(dá)菌株的制備及目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測

挑選邊緣光滑，大小均一的單菌落為模板進(jìn)行菌落PCR，找到陽性菌落。將菌落PCR陽性單菌落保存并擴(kuò)大培養(yǎng)，送上海Invitrogen生物工程公司進(jìn)行序列測定，收到測序結(jié)果后，與在NCBI上查詢的原始序列對比，進(jìn)一步確定陽性結(jié)果的真實性。提取重組質(zhì)粒, 然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL 21。低溫?fù)u床誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)蛋白[14]，并進(jìn)行SDS-Page 蛋白表達(dá)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥RNA的提取

RNA的質(zhì)量直接影響后續(xù)實驗，由圖1的電泳結(jié)果可以看到，一個泳道共出現(xiàn)了3條條帶：28 S、18 S、5 S。3條條帶很清晰，沒有拖帶，說明RNA基本沒有降解，提取質(zhì)量良好，RNA可用于后續(xù)實驗。

圖1 擬南芥總RNA提取凝膠電泳圖

2.2 目標(biāo)基因AT5G47610的PCR擴(kuò)增

以擬南芥cDNA為模板，用已設(shè)計好的帶有酶切位點(Bam H 1和Sac 1)的目的基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并膠回收結(jié)果如圖2，可以看到在Marker 560 bp位置有明亮的目標(biāo)條帶，通過灰度值計算其濃度進(jìn)行下一步的實驗。

圖2 AT5G47610基因膠回收后的電泳結(jié)果

2.3 載體片段連接體系檢測

如圖3所示，a、b泳道為Bam H 1 和Sac 1雙酶切后產(chǎn)物，b泳道雙酶切獲得的2條條帶說明AT5G47610基因已成功連接到克隆載體PET 32 a中。

圖3 載體片段連接體系酶切結(jié)果

2.4 目標(biāo)基因蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，收集菌體制樣后，SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖4。對比未添加IPTG的實驗組，可以看到添加IPTG的實驗組在40 KD蛋白Marker處均有蛋白的表達(dá)，但由于IPTG添加比例不同，目標(biāo)蛋白亮度不一致。0.2 mM IPTG是最為合適的誘導(dǎo)濃度。

注：a—泳道無IPTG；b—泳道0.4 mM IPTG；c—泳道0.3 mM IPTG；d—泳道0.2 mM IPTG；e—泳道0.1 mM IPTG;f—泳道0.05 mM IPTG。圖4 AT 5 g 47610蛋白表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果

3 討 論

本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)了一個具有鋅指結(jié)構(gòu)的AT 5 g 47610蛋白，而它的同源蛋白AT 2 g 02960(ATPRF 1)經(jīng)體外泛素化實驗驗證，為一個E 3連接酶[15],另2個同源蛋白AT 5 g 43200(AtHHR 2)[16]和AT 5 g 43420(ATL 16)[17]也被證實具有E 3連接酶的功能。因此猜測同樣具有鋅指結(jié)構(gòu)的AT 5 g 47610蛋白也同樣具有E 3連接酶的功能。為此，本研究進(jìn)行了AT5G47610目的基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建，并成功誘導(dǎo)了目標(biāo)蛋白的表達(dá)，為后續(xù)鑒定AT 5 g 47610蛋白的E 3連接酶活性與奠定基礎(chǔ)。

E 3連接酶是一種與抗逆相關(guān)的泛素連接酶。根據(jù)結(jié)構(gòu)與功能機(jī)制，E 3連接酶家族主要有三大類[18]：HECT家族，U-box蛋白家族和RING-finger(鋅指)家族。其中RING-finger 家族的E 3 連接酶發(fā)現(xiàn)較晚，但其種類龐大且功能復(fù)雜，成為近年來研究的熱點。Ryu等在篩選擬南芥ABA不敏感突變體的過程中鑒定出AtAIRP1，它能夠編碼一個鋅指類型泛素E 3連接酶[19]。Ding等發(fā)現(xiàn)，擬南芥里面一個鋅指蛋白CHYR 1，具有E 3連接酶的活性，能夠提高植物的耐旱性，而其活性是通過被蛋白激酶SnRK 2.6磷酸化來調(diào)控的[20]。Park等從延遲萌發(fā)的水稻T-DNA突變體中鑒定出一個RING-finger類型泛素E 3連接酶OsDSG 1，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，osdsg1突變體對干旱的耐受性增強(qiáng)，一系列ABA信號通路相關(guān)及響應(yīng)的基因和都能夠在突變體中被誘導(dǎo)表達(dá)，說明OsDSG 1是依賴于ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的干旱脅迫響應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)子[21]。

篩選與鑒定擬南芥中同抗逆境相關(guān)的E 3連接酶，分析其抗逆機(jī)制，再通過基因工程的手段，將相關(guān)的E 3連接酶基因?qū)氲狡渌r(nóng)作物當(dāng)中，將有助于獲得抗逆的新品種，從而實現(xiàn)傳統(tǒng)育種模式的新改革。