陳俊升，焦 言，韓大力，楊文鋒

(1.濟南大學 山東省醫(yī)學科學院 醫(yī)學與生命科學學院，濟南 250022； 2.山東大學附屬山東省腫瘤醫(yī)院a.胸外科，b.放療科，濟南 250117； 3.曹縣人民醫(yī)院介入科，山東 菏澤 274400)

食管癌是全球第八大癌癥，也是癌癥相關死亡的第六大主要原因[1]，其發(fā)病率逐年上升，已嚴重威脅著人類的健康。根據(jù)組織學分類，食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和腺癌是食管癌的兩種主要病理類型，其中前者占我國食管癌病例的90%[2]。程序性細胞死亡受體1(programmed cell death-1,PD-1)和程序性細胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)是一對抑制性的協(xié)同刺激分子，其表達是T淋巴細胞介導的免疫反應的關鍵調(diào)節(jié)因素[3]。PD-1與PD-L1結(jié)合后能傳遞抑制信號，營造免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，幫助腫瘤逃避免疫殺傷，促進腫瘤的進展[4]。研究證實[5-7]，PD-1/PD-L1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，并且影響患者的預后。PD-1/PD-L1作為腫瘤免疫治療靶點成為研究的熱點，但目前關于PD-1/PD-L1在食管癌中的報道相對較少。本研究主要探討PD-1和PD-L1在ESCC中的表達情況，并研究其與各臨床病理因素之間的關系和預后價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2017年12月在山東省腫瘤醫(yī)院接受手術治療的食管癌患者術后標本67例，經(jīng)術后病理證實均為ESCC，所有患者術前均未接受過針對腫瘤的任何新輔助治療或生物治療，無全身免疫系統(tǒng)疾病，未患其他腫瘤。臨床評估病情，所有患者術后至復發(fā)或末次隨訪期間均接受了數(shù)周期的化療，未行其他抗腫瘤治療。分期按照美國癌癥聯(lián)合委員會第8版食管癌分期標準[8]。入組患者臨床病理資料通過本院病案管理系統(tǒng)查閱獲得，其中男46例，女21例，年齡50～77歲，平均(62±7)歲，<60歲者24例，≥60歲者43例。分化程度：高分化20例，中分化21例，低分化26例。腫瘤部位：胸上段8例，胸中段38例，胸下段21例。其中33例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。35例

1.2免疫組織化學法檢測PD-1/PD-L1的表達 將標本切制成4 μm左右厚切片，經(jīng)二甲苯脫蠟和不同濃度梯度的無水乙醇脫蠟和水化后，用3% H2O2溶液避光室溫孵育10～15 min，然后在0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)中微波加熱進行抗原修復15 min左右。加入兔抗人PD-1單克隆抗體(英國Abcam公司)和兔抗人PD-L1多克隆抗體(英國Abcam公司)，4 ℃孵育過夜。加入二抗(MaxVisionTM)，室溫孵育20 min，然后磷酸鹽緩沖液沖洗3次。最后加顯色劑顯色，蘇木精復染，用dH2O洗滌數(shù)次后封片，光鏡下觀察拍照。

1.3表達結(jié)果判定 不同研究的判定標準并不統(tǒng)一。本研究隨機選擇5個高倍視野，計算陽性染色細胞所占的比例，取平均值作為每個標本的最終結(jié)果。參考相關文獻[9-10]，分別將具有≥5%和≥10%腫瘤細胞染色的標本定義為表達陽性。樣本表達情況由兩名病理醫(yī)師獨立讀片和評估，出現(xiàn)意見不一時，則重新拍照計數(shù)并進行討論，直至達成共識。

1.4觀察指標 顯微鏡下觀察到染色呈黃(褐)色視為陽性。評估病情有無進展主要通過影像學檢查(增強CT、鋇餐造影)，出現(xiàn)局部復發(fā)(食管壁增厚或浸潤附近組織器官)、新的淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移均視為進展。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，用Kaplan-Meier和Log-rank法進行生存分析，Cox回歸模型用于單因素和多因素生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1PD-1/PD-L1表達情況 以5%和10%陽性染色作為PD-1/PD-L1陽性表達臨界值，PD-1陽性表達率分別為67.2%(45/67)和61.2%(41/67)，PD-L1陽性表達率分別為31.3%(21/67)和25.4%(17/67)，見圖1。

2.2PD-1/PD-L1表達與臨床病理因素的關系 不同性別、年齡、分化程度、腫瘤長徑、吸煙、飲酒、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤部位PD-1和PD-L1的陽性表達率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；PD-L1的表達與腫瘤T分期有關，

2.3PD-1/PD-L1表達與腫瘤標志物的關系 無論以5%還是10%作為表達臨界值，PD-1和PD-L1在不同水平的CEA、NSE和Cyfra21-1的患者癌組織中的表達陽性率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

1a：PD-1陰性；1b：PD-1陽性；1c：PD-L1陰性；1d：PD-L1陽性

ESCC：食管鱗狀細胞癌；PD-1：程序性細胞死亡受體1；PD-L1：程序性細胞死亡配體1

表2 PD-1/PD-L1表達與腫瘤標志物的關系 [例(%)]

ESCC：食管鱗狀細胞癌；PD-1：程序性細胞死亡受體1；PD-L1：程序性細胞死亡配體1；CEA：癌胚抗原；NSE：神經(jīng)元特異性烯醇化酶；Cyfra21-1：細胞角蛋白19片段抗原

2.4生存和預后影響因素分析 隨訪截止日期2018年11月5日，59例患者出現(xiàn)疾病進展，總體中位無進展生存期(progression free survival,PFS)為12.29個月。單因素生存分析結(jié)果顯示，PD-1表達和腫瘤部位與PFS有關。5%作為臨界值時，PD-1表達陽性和陰性患者中位PFS分別為10.0個月和13.2個月，10%作為臨界值時對應的中位PFS分別為9.6個月和13.1個月，PD-1陽性患者的PFS比陰性患者短(5%作為臨界值：χ2=10.270，P=0.002，HR=2.606；10%作為臨界值：χ2=8.176，P=0.005，HR=2.252)(表3、圖2a和2b)。胸上、中段腫瘤患者中位PFS比胸下段患者短(10.1個月比14.0個月)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.136，P=0.004)(圖2c)。多因素生存分析結(jié)果顯示，腫瘤部位和PD-1表達是患者PFS的預后因素(P<0.05)。見表4。

3 討 論

表3 單因素Cox回歸模型分析與PFS相關的危險因素

PFS：無進展生存期；PD-1：程序性細胞死亡受體1；PD-L1：程序性細胞死亡配體1

表4 多因素Cox回歸模型分析與PFS相關的危險因素

PFS：無進展生存期；PD-1：程序性細胞死亡受體1；PD-L1：程序性細胞死亡配體1

2a：5%為臨界值PD-1表達與PFS；2b：10%為臨界值 PD-1表達與PFS；2c：腫瘤部位與PFS

圖2 ESCC患者的生存分析

本研究結(jié)果顯示，PD-1和PD-L1在ESCC患者腫瘤組織中存在過表達。有研究比較了癌組織和正常組織，發(fā)現(xiàn)前者PD-1和PD-L1的陽性表達率遠高于后者，也說明PD-1/PD-L1表達可能與腫瘤的發(fā)生有關[17-18]。本研究結(jié)果顯示不同部位的腫瘤PD-1和PD-L1表達陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，Chen等[10]發(fā)現(xiàn)食管不同位置癌的PD-L1陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。多項研究顯示PD-L1的表達與腫瘤浸潤深度有關[17,19]，本研究也得出類似結(jié)論，提示PD-L1可能會促進腫瘤的進展。以往研究大多數(shù)是選擇一個固定的陽性表達臨界值，本研究分別以5%和10%作為表達臨界值，結(jié)果提示臨界值的選擇會影響最終的統(tǒng)計結(jié)果，這也是不同研究得出分歧結(jié)論的原因之一。有研究提示表達臨界值的選擇會影響對PD-1/PD-L1預后價值的判斷[19]。

通過檢索相關數(shù)據(jù)庫，尚未發(fā)現(xiàn)關于PD-1/PD-L1表達與ESCC患者血中腫瘤標志物關系的文獻報道。因此，本研究納入了本院針對食管癌患者常檢測的3種腫瘤標志物：CEA、NSE和Cyfra21-1，并分析其與PD-1/PD-L1表達的關系。結(jié)果顯示，CEA、NSE和Cyfra21-1陽性率分別為45%、20%和32.5%。腫瘤標志物是一大類化學物質(zhì)，某些腫瘤標志物水平升高會提示特定的腫瘤存在，如CEA與結(jié)直腸癌,甲胎蛋白與肝癌,NSE與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。目前ESCC尚未發(fā)現(xiàn)比較特異性的腫瘤標志物。傳統(tǒng)的腫瘤標志物，如CEA、Cyfra21-1可輔助用于診斷和評估ESCC進展，但這些腫瘤標志物在診斷ESCC時靈敏度較低。有研究報道CEA對ESCC診斷的個體靈敏度約為28%[20]，Yamamoto等[21]研究結(jié)果示Cyfra21-1的靈敏度達47.9%，特異度為100%，所以Cyfra21-1是ESCC的重要標志物。有研究發(fā)現(xiàn)Cyfra21-1和CEA可能有助于預測ESCC患者對放化療的敏感性[22]。這些結(jié)果表明，傳統(tǒng)ESCC腫瘤標志物的診斷敏感性雖然不高，但可起到輔助診斷和評估療效的作用。本研究納入的3種腫瘤標志物在ESCC中陽性率均不高，說明對診斷的特異度不大，對其進行檢測可起到輔助診斷作用，金標準仍依然靠病理學檢查。PD-1/PD-L1可促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，腫瘤標志物水平在一定程度上可對疾病狀態(tài)進行評估，但本研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1的表達與所選3種腫瘤標志物水平無關，提示兩者之間并不存在協(xié)同聯(lián)系，但此結(jié)論仍需要大量的數(shù)據(jù)來進一步證實。

目前相關研究結(jié)果表明，PD-1/PD-L1表達與預后的關系尚存有爭議。有研究認為陽性表達提示預后差[9,23]，也有研究持不同觀點[24-26]。本研究結(jié)果顯示，PD-1陽性表達患者的PFS較陰性表達患者差，多因素分析得出PD-1表達是PFS的預后因素，但PD-L1與PFS無相關性。另外，腫瘤部位可能影響患者PFS，胸下段食管癌患者中位PFS長于胸中、上段患者，但其統(tǒng)計學意義有待進一步驗證。本研究入組樣本量偏少，這可能在一定程度上對結(jié)果造成偏倚。另外，由于大部分患者術后時間偏短，目前尚未分析PD-1/PD-L1的表達與總生存率的關系。未來需要大量的研究來獲取更多數(shù)據(jù)，進一步確定PD-1/PD-L1的預后價值。

食管癌的標準療法包括手術切除、化學治療和放射治療，據(jù)報道，多療法相結(jié)合的多學科綜合治療是最有效的[27-28]。有研究提示在常規(guī)手段治療時配合抗PD-1/PD-L1輔助治療可能會為患者帶來更大的生存獲益[29]。目前已存在多種抗PD-1/PD-L1藥物，有些已被批準用于臨床，而有些仍處于試驗階段。未來的研究應著重測試這些藥物的療效以及用藥安全性，并評估它與其他癌癥療法結(jié)合后的綜合受益情況。