陳俊升，焦 言，韓大力，楊文鋒

(1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250022； 2.山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院a.胸外科，b.放療科，濟(jì)南 250117； 3.曹縣人民醫(yī)院介入科，山東 菏澤 274400)

食管癌是全球第八大癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的第六大主要原因[1]，其發(fā)病率逐年上升，已嚴(yán)重威脅著人類的健康。根據(jù)組織學(xué)分類，食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和腺癌是食管癌的兩種主要病理類型，其中前者占我國(guó)食管癌病例的90%[2]。程序性細(xì)胞死亡受體1(programmed cell death-1,PD-1)和程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)是一對(duì)抑制性的協(xié)同刺激分子，其表達(dá)是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素[3]。PD-1與PD-L1結(jié)合后能傳遞抑制信號(hào)，營(yíng)造免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，幫助腫瘤逃避免疫殺傷，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[4]。研究證實(shí)[5-7]，PD-1/PD-L1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，并且影響患者的預(yù)后。PD-1/PD-L1作為腫瘤免疫治療靶點(diǎn)成為研究的熱點(diǎn)，但目前關(guān)于PD-1/PD-L1在食管癌中的報(bào)道相對(duì)較少。本研究主要探討PD-1和PD-L1在ESCC中的表達(dá)情況，并研究其與各臨床病理因素之間的關(guān)系和預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2017年12月在山東省腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的食管癌患者術(shù)后標(biāo)本67例，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)均為ESCC，所有患者術(shù)前均未接受過針對(duì)腫瘤的任何新輔助治療或生物治療，無全身免疫系統(tǒng)疾病，未患其他腫瘤。臨床評(píng)估病情，所有患者術(shù)后至復(fù)發(fā)或末次隨訪期間均接受了數(shù)周期的化療，未行其他抗腫瘤治療。分期按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)第8版食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)[8]。入組患者臨床病理資料通過本院病案管理系統(tǒng)查閱獲得，其中男46例，女21例，年齡50～77歲，平均(62±7)歲，<60歲者24例，≥60歲者43例。分化程度：高分化20例，中分化21例，低分化26例。腫瘤部位：胸上段8例，胸中段38例，胸下段21例。其中33例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。35例

1.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PD-1/PD-L1的表達(dá) 將標(biāo)本切制成4 μm左右厚切片，經(jīng)二甲苯脫蠟和不同濃度梯度的無水乙醇脫蠟和水化后，用3% H2O2溶液避光室溫孵育10～15 min，然后在0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)中微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)15 min左右。加入兔抗人PD-1單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)和兔抗人PD-L1多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)，4 ℃孵育過夜。加入二抗(MaxVisionTM)，室溫孵育20 min，然后磷酸鹽緩沖液沖洗3次。最后加顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染，用dH2O洗滌數(shù)次后封片，光鏡下觀察拍照。

1.3表達(dá)結(jié)果判定 不同研究的判定標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一。本研究隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，計(jì)算陽(yáng)性染色細(xì)胞所占的比例，取平均值作為每個(gè)標(biāo)本的最終結(jié)果。參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]，分別將具有≥5%和≥10%腫瘤細(xì)胞染色的標(biāo)本定義為表達(dá)陽(yáng)性。樣本表達(dá)情況由兩名病理醫(yī)師獨(dú)立讀片和評(píng)估，出現(xiàn)意見不一時(shí)，則重新拍照計(jì)數(shù)并進(jìn)行討論，直至達(dá)成共識(shí)。

1.4觀察指標(biāo) 顯微鏡下觀察到染色呈黃(褐)色視為陽(yáng)性。評(píng)估病情有無進(jìn)展主要通過影像學(xué)檢查(增強(qiáng)CT、鋇餐造影)，出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)(食管壁增厚或浸潤(rùn)附近組織器官)、新的淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均視為進(jìn)展。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，用Kaplan-Meier和Log-rank法進(jìn)行生存分析，Cox回歸模型用于單因素和多因素生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PD-1/PD-L1表達(dá)情況 以5%和10%陽(yáng)性染色作為PD-1/PD-L1陽(yáng)性表達(dá)臨界值，PD-1陽(yáng)性表達(dá)率分別為67.2%(45/67)和61.2%(41/67)，PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率分別為31.3%(21/67)和25.4%(17/67)，見圖1。

2.2PD-1/PD-L1表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 不同性別、年齡、分化程度、腫瘤長(zhǎng)徑、吸煙、飲酒、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤部位PD-1和PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PD-L1的表達(dá)與腫瘤T分期有關(guān)，

2.3PD-1/PD-L1表達(dá)與腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系 無論以5%還是10%作為表達(dá)臨界值，PD-1和PD-L1在不同水平的CEA、NSE和Cyfra21-1的患者癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

1a：PD-1陰性；1b：PD-1陽(yáng)性；1c：PD-L1陰性；1d：PD-L1陽(yáng)性

ESCC：食管鱗狀細(xì)胞癌；PD-1：程序性細(xì)胞死亡受體1；PD-L1：程序性細(xì)胞死亡配體1

表2 PD-1/PD-L1表達(dá)與腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系 [例(%)]

ESCC：食管鱗狀細(xì)胞癌；PD-1：程序性細(xì)胞死亡受體1；PD-L1：程序性細(xì)胞死亡配體1；CEA：癌胚抗原；NSE：神經(jīng)元特異性烯醇化酶；Cyfra21-1：細(xì)胞角蛋白19片段抗原

2.4生存和預(yù)后影響因素分析 隨訪截止日期2018年11月5日，59例患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展，總體中位無進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)為12.29個(gè)月。單因素生存分析結(jié)果顯示，PD-1表達(dá)和腫瘤部位與PFS有關(guān)。5%作為臨界值時(shí)，PD-1表達(dá)陽(yáng)性和陰性患者中位PFS分別為10.0個(gè)月和13.2個(gè)月，10%作為臨界值時(shí)對(duì)應(yīng)的中位PFS分別為9.6個(gè)月和13.1個(gè)月，PD-1陽(yáng)性患者的PFS比陰性患者短(5%作為臨界值：χ2=10.270，P=0.002，HR=2.606；10%作為臨界值：χ2=8.176，P=0.005，HR=2.252)(表3、圖2a和2b)。胸上、中段腫瘤患者中位PFS比胸下段患者短(10.1個(gè)月比14.0個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.136，P=0.004)(圖2c)。多因素生存分析結(jié)果顯示，腫瘤部位和PD-1表達(dá)是患者PFS的預(yù)后因素(P<0.05)。見表4。

3 討 論

表3 單因素Cox回歸模型分析與PFS相關(guān)的危險(xiǎn)因素

PFS：無進(jìn)展生存期；PD-1：程序性細(xì)胞死亡受體1；PD-L1：程序性細(xì)胞死亡配體1

表4 多因素Cox回歸模型分析與PFS相關(guān)的危險(xiǎn)因素

PFS：無進(jìn)展生存期；PD-1：程序性細(xì)胞死亡受體1；PD-L1：程序性細(xì)胞死亡配體1

2a：5%為臨界值PD-1表達(dá)與PFS；2b：10%為臨界值 PD-1表達(dá)與PFS；2c：腫瘤部位與PFS

圖2 ESCC患者的生存分析

本研究結(jié)果顯示，PD-1和PD-L1在ESCC患者腫瘤組織中存在過表達(dá)。有研究比較了癌組織和正常組織，發(fā)現(xiàn)前者PD-1和PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)率遠(yuǎn)高于后者，也說明PD-1/PD-L1表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[17-18]。本研究結(jié)果顯示不同部位的腫瘤PD-1和PD-L1表達(dá)陽(yáng)性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Chen等[10]發(fā)現(xiàn)食管不同位置癌的PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多項(xiàng)研究顯示PD-L1的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)[17,19]，本研究也得出類似結(jié)論，提示PD-L1可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。以往研究大多數(shù)是選擇一個(gè)固定的陽(yáng)性表達(dá)臨界值，本研究分別以5%和10%作為表達(dá)臨界值，結(jié)果提示臨界值的選擇會(huì)影響最終的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，這也是不同研究得出分歧結(jié)論的原因之一。有研究提示表達(dá)臨界值的選擇會(huì)影響對(duì)PD-1/PD-L1預(yù)后價(jià)值的判斷[19]。

通過檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于PD-1/PD-L1表達(dá)與ESCC患者血中腫瘤標(biāo)志物關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究納入了本院針對(duì)食管癌患者常檢測(cè)的3種腫瘤標(biāo)志物：CEA、NSE和Cyfra21-1，并分析其與PD-1/PD-L1表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果顯示，CEA、NSE和Cyfra21-1陽(yáng)性率分別為45%、20%和32.5%。腫瘤標(biāo)志物是一大類化學(xué)物質(zhì)，某些腫瘤標(biāo)志物水平升高會(huì)提示特定的腫瘤存在，如CEA與結(jié)直腸癌,甲胎蛋白與肝癌,NSE與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。目前ESCC尚未發(fā)現(xiàn)比較特異性的腫瘤標(biāo)志物。傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物，如CEA、Cyfra21-1可輔助用于診斷和評(píng)估ESCC進(jìn)展，但這些腫瘤標(biāo)志物在診斷ESCC時(shí)靈敏度較低。有研究報(bào)道CEA對(duì)ESCC診斷的個(gè)體靈敏度約為28%[20]，Yamamoto等[21]研究結(jié)果示Cyfra21-1的靈敏度達(dá)47.9%，特異度為100%，所以Cyfra21-1是ESCC的重要標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)Cyfra21-1和CEA可能有助于預(yù)測(cè)ESCC患者對(duì)放化療的敏感性[22]。這些結(jié)果表明，傳統(tǒng)ESCC腫瘤標(biāo)志物的診斷敏感性雖然不高，但可起到輔助診斷和評(píng)估療效的作用。本研究納入的3種腫瘤標(biāo)志物在ESCC中陽(yáng)性率均不高，說明對(duì)診斷的特異度不大，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)可起到輔助診斷作用，金標(biāo)準(zhǔn)仍依然靠病理學(xué)檢查。PD-1/PD-L1可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，腫瘤標(biāo)志物水平在一定程度上可對(duì)疾病狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估，但本研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1的表達(dá)與所選3種腫瘤標(biāo)志物水平無關(guān)，提示兩者之間并不存在協(xié)同聯(lián)系，但此結(jié)論仍需要大量的數(shù)據(jù)來進(jìn)一步證實(shí)。

目前相關(guān)研究結(jié)果表明，PD-1/PD-L1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系尚存有爭(zhēng)議。有研究認(rèn)為陽(yáng)性表達(dá)提示預(yù)后差[9,23]，也有研究持不同觀點(diǎn)[24-26]。本研究結(jié)果顯示，PD-1陽(yáng)性表達(dá)患者的PFS較陰性表達(dá)患者差，多因素分析得出PD-1表達(dá)是PFS的預(yù)后因素，但PD-L1與PFS無相關(guān)性。另外，腫瘤部位可能影響患者PFS，胸下段食管癌患者中位PFS長(zhǎng)于胸中、上段患者，但其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究入組樣本量偏少，這可能在一定程度上對(duì)結(jié)果造成偏倚。另外，由于大部分患者術(shù)后時(shí)間偏短，目前尚未分析PD-1/PD-L1的表達(dá)與總生存率的關(guān)系。未來需要大量的研究來獲取更多數(shù)據(jù)，進(jìn)一步確定PD-1/PD-L1的預(yù)后價(jià)值。

食管癌的標(biāo)準(zhǔn)療法包括手術(shù)切除、化學(xué)治療和放射治療，據(jù)報(bào)道，多療法相結(jié)合的多學(xué)科綜合治療是最有效的[27-28]。有研究提示在常規(guī)手段治療時(shí)配合抗PD-1/PD-L1輔助治療可能會(huì)為患者帶來更大的生存獲益[29]。目前已存在多種抗PD-1/PD-L1藥物，有些已被批準(zhǔn)用于臨床，而有些仍處于試驗(yàn)階段。未來的研究應(yīng)著重測(cè)試這些藥物的療效以及用藥安全性，并評(píng)估它與其他癌癥療法結(jié)合后的綜合受益情況。