黃 柯，孟元光

(解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100039)

統(tǒng)計學(xué)研究顯示當(dāng)前全球范圍內(nèi)新增癌癥病例約1800萬，死亡人數(shù)達(dá)960萬，其中女性癌癥中宮頸癌的發(fā)病率占13.1%，死亡率達(dá)6.9%[1]。我國新發(fā)腫瘤病例380.4萬例，死亡病例高達(dá)229.6萬例，這意味著我國癌癥新發(fā)例數(shù)占全球總數(shù)的20%以上，同時在女性發(fā)病率前10位的癌癥中，宮頸癌和子宮癌的發(fā)病率及死亡率均排名靠前[2]。隨著中國步入老齡化社會，老年女性子宮頸癌和宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率有所升高[3]。宮頸癌是婦科惡性腫瘤中發(fā)病率最高的生殖系統(tǒng)腫瘤，雖然目前液基薄層細(xì)胞檢測技術(shù)的成熟和人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)疫苗的應(yīng)用，子宮頸癌的發(fā)病率有所降低，但由于HPV疫苗價格昂貴，尚不能在我國普及[4]。由于宮頸癌篩查并不普及，我國宮頸癌的發(fā)病率和死亡率仍高于發(fā)達(dá)國家[5]。近年來子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率也呈上升趨勢。一方面是由于宮頸癌早期診斷率的提高以及子宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變階段手術(shù)切除率的增加，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率的升高；另一方面，影響子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的高危因素持續(xù)存在，如2型糖尿病、不孕癥、多囊卵巢綜合征以及終生拒絕妊娠女性的增加都導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年升高[6]。

卵巢癌的發(fā)病率雖然不高，但其具有易復(fù)發(fā)、易耐藥以及早期難發(fā)現(xiàn)的特點(diǎn)而導(dǎo)致卵巢癌的預(yù)后非常差，是致死率較高的女性生殖系統(tǒng)腫瘤[7]。以上海為例，卵巢癌的發(fā)病率和死亡率近40年來未有明顯改觀[8]。因此，尋找能夠早期篩查宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌的手段，以期早診斷、早治療非常重要?，F(xiàn)就高通量測序技術(shù)在上述腫瘤早期篩查中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 高通量測序的運(yùn)用

高通量測序又稱下一代測序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)，其能同時對幾十萬到幾百萬條的DNA分子并行序列測序。相對于第1代焦磷酸法測序技術(shù)，NGS在速度方面有明顯提高，并可同時獲取豐富的基因遺傳學(xué)信息?；贜GS技術(shù)相關(guān)的腫瘤學(xué)研究日益增多，有潛在應(yīng)用價值的方法如下。

1.1靶向測序 靶向測序是針對目標(biāo)基因區(qū)域設(shè)計芯片和探針，區(qū)域DNA富集后進(jìn)行深度測序分析，具有常規(guī)檢測方法不可比擬的優(yōu)勢[9]。相較于全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，靶向區(qū)域測序的目標(biāo)序列較少。靶向測序的優(yōu)點(diǎn)是測序深度高、成本低、速度較快，可獲得更為準(zhǔn)確的測序結(jié)果。靶向測序常用于獲取疾病相關(guān)致病基因和易感基因的信息，用于指導(dǎo)篩選臨床高危人群和制定個性化治療方案；缺點(diǎn)是無法進(jìn)行探索性研究，不能識別未知突變基因[10]。

1.2外顯子測序 外顯子測序的靶向檢測目標(biāo)是編碼外顯子的基因序列，是一種將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測序的基因組分析方法。外顯子組包括約1%的基因組、約85%的致病突變，外顯子組測序可檢測出單核苷酸變異，小部分基因插入或缺失，以及罕見的新生突變，可有效檢測惡性婦科腫瘤疾病的基因遺傳率[11]。外顯子測序相對于基因組重測序成本低，對研究已知基因的單核苷酸變異、基因插入或缺失等具有較大優(yōu)勢，但外顯子測序無法研究基因組的結(jié)構(gòu)變異如染色體斷裂重組等。由于測序未涉及內(nèi)含子序列，所以并不適用于研究腫瘤的調(diào)控機(jī)制[12]。由于目前對腫瘤發(fā)生學(xué)的理論研究主要集中在基因突變以及調(diào)控異常方面，所以除個別遺傳性腫瘤外，全外顯子組測序尚可滿足臨床需求。但隨著對腫瘤發(fā)生機(jī)制研究的深入，癌癥早期如與調(diào)控序列有關(guān)的話，外顯子測序就不能滿足臨床需求。

1.3甲基化測序 甲基化測序能直接對任何物種的高甲基化片段進(jìn)行測序而無須知道基因組的序列信息。DNA基因甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，在維持細(xì)胞功能、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用[13]。對所有富集的甲基化DNA片段進(jìn)行高通量測序能夠明確全基因組的甲基化狀態(tài)，為表觀遺傳學(xué)中的調(diào)控分析提供了更有利的切入點(diǎn)。有學(xué)者研究了卵巢癌組織中鈣黏蛋白基因CDH10、CDH13以及CDH18的甲基化情況，與健康對照組相比，卵巢癌標(biāo)本中CDH13基因的甲基化顯著增高，CDH10基因散發(fā)甲基化，而CDH18基因甲基化喪失[14]。上述研究表明，鈣黏蛋白基因的甲基化可能是卵巢癌進(jìn)展的機(jī)制之一；其次，由于CDH13基因在卵巢癌早期的甲基化頻率較高，對胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點(diǎn)的甲基化分析可能是下一步研究卵巢癌早期篩查生物標(biāo)志物的主要方向之一[15]。

1.4單細(xì)胞全基因組測序 單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)是在單細(xì)胞水平對全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測序的技術(shù)。它是將分離的單個細(xì)胞的微量全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得其完整基因組后探尋細(xì)胞群體差異和細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系[16]。已有研究通過激光顯微切割分離卵巢癌石蠟切片的單細(xì)胞，然后進(jìn)行單細(xì)胞全基因組測序，分析不同卵巢癌細(xì)胞的基因狀態(tài)[17]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同單細(xì)胞中相同基因座處均存在甲基化和未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤，即同一細(xì)胞亞群中顯示異質(zhì)DNA甲基化狀態(tài)[17]，不過由于成本原因，目前該技術(shù)主要用于科研領(lǐng)域。

2 NGS篩查婦科惡性腫瘤

目前在婦科惡性腫瘤領(lǐng)域，早期篩查時使用NGS相關(guān)技術(shù)的報道較少，一方面由于NGS篩查成本較傳統(tǒng)方法高；另一方面由于NGS能檢測到的突變較多，但又缺乏大規(guī)模人群的正常對照數(shù)據(jù)進(jìn)行解讀，導(dǎo)致NGS的臨床應(yīng)用受到限制。NGS應(yīng)用于婦科惡性腫瘤的優(yōu)勢也較多，是當(dāng)前臨床研究的熱點(diǎn)。

2.1NGS檢測在宮頸癌篩查中的應(yīng)用 宮頸癌傳統(tǒng)早期篩查方法已經(jīng)很成熟，可直接取材、成本較低，且樣本質(zhì)量較好，質(zhì)控體系也較完善。宮頸癌的早期篩查主要以高危型HPV檢測聯(lián)合液基薄層細(xì)胞檢測技術(shù)為主[18]。但目前還沒有更好的方法對高危型HPV感染者進(jìn)行分層，畢竟終生高危型HPV陽性且不罹患宮頸癌的女性也并非少數(shù)。如何降低高危型HPV陽性女性的心理負(fù)擔(dān)和篩查頻率，如何進(jìn)行進(jìn)一步分層是臨床急需解決的問題[19]。目前雖然有學(xué)者對包括甲基化檢測、HPV整合位點(diǎn)分析等方法進(jìn)行了有益探索，但得到的數(shù)據(jù)相對于傳統(tǒng)方法仍然較少[20]。有學(xué)者利用NGS檢測在宮頸癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)12個基因啟動子(ARHGAP6、HAND2、LHX9、HEY2、NKX2-2、PCDH10、PITX2、PROX1、TBX3、IKBKG、RAB6C和DAPK1)存在甲基化，這為宮頸癌的早期檢測和臨床管理提供了基因特異性甲基化方面的有效生物標(biāo)志物[21]。

2.2NGS檢測在子宮內(nèi)膜癌篩查中的應(yīng)用 子宮內(nèi)膜癌的早期篩查目前尚未有規(guī)范內(nèi)容，篩查多依賴于婦科超聲或磁共振成像結(jié)合子宮內(nèi)膜活檢技術(shù)，更早期的篩查多是在行子宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測過程中捕獲到從宮腔脫落的異形細(xì)胞間接發(fā)現(xiàn)，這屬于機(jī)會性因素，不能作為標(biāo)準(zhǔn)篩查方法。

因子宮內(nèi)膜高?；颊叨嗪喜⒂蟹逝?，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜活檢難度增大，并有漏檢風(fēng)險，常規(guī)活檢無法做到對子宮內(nèi)膜癌的早期準(zhǔn)確篩查[22]。目前利用子宮頸部細(xì)胞DNA的異常變化來推測子宮內(nèi)膜癌的早期癌前病變是一個新的研究方向，已有學(xué)者利用診斷性刮宮或子宮腔灌洗細(xì)胞進(jìn)行循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)測序分析，以預(yù)測或輔助子宮內(nèi)膜癌的早期診斷[23]。有研究分析了107例接受宮腔鏡檢查和刮宮術(shù)患者的宮灌洗液樣本,并從灌洗液中分離出細(xì)胞中和游離的DNA，然后進(jìn)行超深度高通量測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7例患者的宮腔鏡檢查經(jīng)典刮除組織中有子宮內(nèi)膜癌的前驅(qū)動突變，大約有50%的女性未在癌癥確診的灌洗液中鑒定出相對較多的等位基因驅(qū)動突變[24-25]。因此，NGS有可能用于子宮內(nèi)膜癌的早期篩查。

Maritschnegg等[23]發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌通過宮腔灌洗收集脫落細(xì)胞進(jìn)行基因突變檢測，可實(shí)現(xiàn)卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的早期檢測，甚至是臨床上尚無癥狀的卵巢癌。Xia等[26]利用NGS技術(shù)結(jié)合18種基因突變檢測方法以及非整倍性檢測方法對子宮內(nèi)膜癌患者和卵巢癌患者進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，對382例子宮內(nèi)膜癌患者的宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行基因檢測發(fā)現(xiàn)，81%的患者基因突變?yōu)殛栃裕渲?8%為早期疾病患者；245例卵巢癌患者中相關(guān)基因突變率為33%，其中34%為早期癌癥患者；而在714例無癌癥的女性中只有1.4%宮頸脫落細(xì)胞基因突變?yōu)殛栃?特異度為99%)；隨后進(jìn)行子宮內(nèi)膜取樣NGS檢測發(fā)現(xiàn)，有93%(114/123)的子宮內(nèi)膜癌患者和45%(23/51)的卵巢癌患者18種基因測序突變?yōu)殛栃裕?25例未患癌者均為陰性；在可獲得血漿的83例卵巢癌患者中，43%的患者ctDNA陽性;檢測血漿和脫落細(xì)胞時，卵巢癌的靈敏度為63%。上述結(jié)果表明，NGS檢測基因突變可作為早期篩查婦科惡性腫瘤的輔助手段。

2.3NGS檢測在卵巢癌篩查中的應(yīng)用 卵巢癌的早期診斷仍是目前臨床無法根本解決的難題。以前對微RNA和長鏈非編碼RNA研究比較多，但現(xiàn)在認(rèn)為微RNA主要與調(diào)控有關(guān)，涉及相關(guān)通路的激活或抑制，因而目前主要用于監(jiān)控和治療癌癥患者，而非早期篩查[27]。癌抗原125(cancer antigen 125，CA125)檢測聯(lián)合婦科超聲檢查組成了現(xiàn)在最常用的婦科惡性腫瘤篩查方法，包括對CA125動態(tài)變化的分析[28]。這些檢測方法雖然成熟，但陽性符合率和假陽性率均不佳，且部分卵巢癌患者早期并無CA125的升高，首發(fā)癥狀即為腹脹、腹水。如何早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌或在癌前病變階段發(fā)現(xiàn)卵巢癌，一直是臨床醫(yī)師和科研人員探索的方向?；诼殉舶┌l(fā)生學(xué)觀點(diǎn)，有研究認(rèn)為卵巢癌是輸卵管來源的惡性腫瘤，在腫瘤組織中已經(jīng)鑒定出輸卵管上皮是高級別漿液性卵巢癌的祖細(xì)胞群之一[29]。同時卵巢子宮內(nèi)膜樣癌和透明細(xì)胞癌均出現(xiàn)了KRAS基因、PIK3CA基因、CTNNB1基因、ARID1A基因以及PTEN基因突變，且TTC28-L1轉(zhuǎn)導(dǎo)以及經(jīng)典的驅(qū)動突變在腫瘤中幾乎普遍存在，這表明L1激活可能發(fā)生在子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的卵巢癌的早期，TTC28-L1轉(zhuǎn)導(dǎo)可用于確定克隆關(guān)系和跟蹤卵巢癌進(jìn)展[30]。最近開展的一項(xiàng)研究是利用ctDNA檢測腫瘤細(xì)胞，其采用的分子檢測技術(shù)為PapGene檢測，以期早期識別小體積的卵巢高級別漿液性癌或漿液性輸卵管上皮內(nèi)癌的癌前病變[31]。NGS在卵巢癌中應(yīng)用的最終目標(biāo)是評估PapGene和ctDNA測試檢測高級別漿液性卵巢癌的作用特征，研究PapGene和ctDNA檢測在高卵巢癌風(fēng)險女性中預(yù)測早期病變和微小卵巢癌病變的價值；確定PapGene試驗(yàn)作為前瞻性隊列研究中高級別漿液性卵巢癌篩查工具的臨床效用[32]。

3 小 結(jié)

從宮頸管細(xì)胞涂片、子宮腔脫落細(xì)胞或灌洗液等得到的樣本中提取基因進(jìn)行NGS，可有效篩查出婦科惡性腫瘤相關(guān)基因的突變，從而為婦科惡性腫瘤的早期篩查提供新思路。高通量基因測序篩查婦科惡性腫瘤的敏感性和準(zhǔn)確度優(yōu)勢是傳統(tǒng)檢查技術(shù)無法超越的?；赾tDNA、無細(xì)胞DNA等新技術(shù)用于NGS獲取樣本信息將更有助于指導(dǎo)婦科惡性腫瘤的臨床靶向治療方案的制定和調(diào)整。目前為實(shí)現(xiàn)癌癥的無創(chuàng)早期篩查，Johns Hopkins Kimmel癌癥中心的科學(xué)家開發(fā)了一種高通量測序檢測血液中微量腫瘤特異性DNA的技術(shù)，其已準(zhǔn)確篩選識別了138例相對早期的結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌患者[33]，證實(shí)NGS用于婦科惡性腫瘤是具有可行性的。也有學(xué)者將NGS與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合起來，但由于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的穩(wěn)定性目前還不能保證，臨床應(yīng)用前景相對較遠(yuǎn)[34]。目前婦科惡性腫瘤NGS早期篩查技術(shù)的發(fā)展方向仍是ctDNA和甲基化檢測，隨著ctDNA技術(shù)的成熟，NGS將更多地應(yīng)用于卵巢漿液性癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮肉瘤、宮頸鱗癌和腺癌的早期篩查?？傊?，應(yīng)用NGS技術(shù)進(jìn)行早期婦科惡性腫瘤的篩查雖然還不完善，但其以無創(chuàng)活檢為目標(biāo)的精準(zhǔn)篩查、精準(zhǔn)治療將是未來婦科惡性腫瘤診治領(lǐng)域的大方向。