周 鋒,李志鋒,王志力,靳 風,張 穎△

(武漢大學中南醫(yī)院：1.內(nèi)分泌科;2.重癥醫(yī)學科，武漢 430071)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種常見的臨床危重癥，它可以由多種原因，如膿毒癥、嚴重創(chuàng)傷、急性胰腺炎等引起。膿毒癥是引起急性肺損傷的最常見原因。脂多糖被認為是引起ARDS的主要原因[1]。脂多糖通過激活中性粒細胞及巨噬細胞等炎癥細胞，如釋放白細胞介素-1β(IL-1β)及白細胞介素-18(IL-18)等。這些炎癥介質(zhì)可以加重機體的炎性反應(yīng)，嚴重影響機體的肺換氣功能，導(dǎo)致低氧血癥。而IL-1β及IL-18的成熟及釋放主要受炎癥小體的調(diào)節(jié)[2]。NLRP3炎癥小體在ARDS的發(fā)病機制中扮演重要角色[3]。胰高糖素樣肽-1(GLP-1) 是腸道L細胞分泌的一種肽類激素，是體內(nèi)調(diào)節(jié)血糖的重要激素。研究發(fā)現(xiàn)GLP-1不僅對機體血糖穩(wěn)定有調(diào)節(jié)作用，還具有抗炎作用[4-5]。利拉魯肽是GLP-1類似物，被廣泛用于肥胖及2型糖尿病的治療。VIBY等[6]研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可以抑制慢性阻塞性肺疾病的炎性反應(yīng)，緩解慢性阻塞性肺疾病的急性發(fā)作。而利拉魯肽對急性肺損傷是否具有保護作用，目前鮮有報道。本研究主要觀察利拉魯肽對脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠ARDS的保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及模型制備 將6～8周健康雄性Balb/c 30只(湖北省疾病預(yù)防控制中心提供)，分為3組，每組10只：對照組、ARDS組、利拉魯肽干預(yù)組。對照組及ARDS組小鼠先給予無菌生理鹽水皮下注射，利拉魯肽干預(yù)組給予利拉魯肽200 μg/kg皮下注射。利拉魯肽皮下注射6 h后，對照組小鼠腹腔注射無菌生理鹽水，ARDS組及利拉魯肽干預(yù)組小鼠腹腔注射10 mg/kg脂多糖[7]。脂多糖注射4 h后，取材做以下指標檢測。

1.2試劑 利拉魯肽(丹麥Novo Nordisk公司)，脂多糖(Sigma公司)，NLRP3抗體(R&D公司)，ASC及caspase-1抗體(Protein Tech公司)；IL-1β及IL-18酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢依萊瑞特生物科技公司)等。

1.3方法

1.3.1病理學檢測 處死小鼠后，用10%甲醛溶液固定小鼠左上肺組織，石蠟包埋后用蘇木精-伊紅(HE)染色。根據(jù)Murakami評分方法[8]，按照0～4級(0級，無；1級，輕；2級，中；3級，強；4級，重)評分對肺損傷程度進行病理評分。

1.3.2肺組織濕/干重(W/D)比值 取左下肺，用濾紙吸干肺表面水分，稱取各組小鼠肺組織濕重后，將肺組織放入烤箱(80 ℃)，48 h，稱干重，計算W/D比值。

1.3.3支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白及炎癥因子水平 采用BCA法檢測BALF的蛋白水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測BALF中IL-1β及IL-18水平。

1.3.4肺組織NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA表達 用RT聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表達。用Trizol法提取總RNA，光譜掃描多功能儀測定RNA的純度和濃度。RNA樣本OD260/OD280值在1.8～2.0范圍內(nèi)。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:取2 μg RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 RT-PCR擴增cDNA：NLRP3上游引物5′-CTC GCA TTG GTT CTG AGC TC -3′；下游引物5′-AGT AAG GCC GGA ATT CAC CA-3′；ASC上游引物5′-CTA TCT GGA GTC GTA TGG CTT GG-3′；下游引物5′-ATG AGT GCT TGC CTG TGC TGG TC-3′；caspase-1上游引物5′-GGC AAG CCA AAT CTT TAT CAC-3′；下游引物5′-GCC ATC TTC TTT GTT CTG TTC-3′；β-actin上游引物5′-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3′；下游引物5′-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3′。反應(yīng)體系為20 μL,擴增條件：95 ℃熱啟動5 min后；95 ℃ 30 s，58 ℃退火延伸30 s，共40循環(huán)。每份樣本重復(fù)檢測3次，取平均Ct值，用相對定量法(2-△△Ct)計算各組小鼠目的基因表達。

A：對照組；B：ARDS組；C：利拉魯肽干預(yù)組

圖1 各組肺組織病理學改變

2 結(jié) 果

2.1肺組織病理學改變 對照組小鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)正常，腹腔注射LPS 4 h后，ARDS組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯破壞，肺內(nèi)出現(xiàn)較多炎癥細胞浸潤，并伴有出血、水腫及透明膜形成。利拉魯肽干預(yù)小鼠上述病理學改變明顯減輕(圖1)。

2.2肺組織W/D比值 同對照組比較，ARDS組小鼠肺W/D明顯升高(P<0.05)，利拉魯肽干預(yù)組小鼠肺W/D較ARDS組小鼠明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠肺組織W/D比值

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與ARDS組比較

表2 各組小鼠BALF中蛋白、IL-1β及IL-18水平

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與ARDS組比較

2.3BAFL中的蛋白、IL-1β及IL-18水平 同對照組比較，ARDS組小鼠BALF中蛋白、IL-1β及IL-18水平明顯升高(P<0.01)，利拉魯肽干預(yù)組小鼠BALF中蛋白、IL-1β及IL-18水平明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.4肺組織NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA表達 同對照組比較，ARDS組小鼠肺組織中NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表達明顯升高，利拉魯肽干預(yù)組小鼠肺組織中NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表達較ARDS組明顯降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表達比較

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.05，與ARDS組比較

3 討 論

ARDS的特征主要表現(xiàn)為肺間質(zhì)水腫、炎癥細胞浸潤、肺上皮通透性增加及蛋白向肺泡腔中滲透，最終導(dǎo)致嚴重的肺換氣功能障礙[9]。本研究顯示，利拉魯肽干預(yù)能改善ARDS小鼠肺組織病理學改變，降低ARDS小鼠肺W/D及蛋白滲出，說明利拉魯肽早期干預(yù)可以改善膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠肺組織損傷。

炎癥細胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在ARDS的發(fā)病機制中扮演重要角色[10]。IL-1β是引起肺內(nèi)炎性反應(yīng)的重要炎癥介質(zhì)，ARDS患者肺泡液內(nèi)IL-1β水平明顯增高[11]。過量的IL-1β?lián)p傷血管內(nèi)皮細胞的完整性，加重肺泡上皮細胞的通透性，引起肺水腫[12]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-18水平升高可以增加急性肺損傷患者的病死率[13]。本研究表明，膿毒癥誘導(dǎo)的ARDS小鼠BALF中炎癥介質(zhì)IL-1β及IL-18水平顯著升高，利拉魯肽預(yù)處理可以顯著降低BALF中IL-1β及IL-18水平，提示利拉魯肽干預(yù)可能是通過抑制IL-1β及IL-18來減輕膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠ARDS。

NLRP3炎癥小體由NLRP3、ASC及caspase-1前體組成，內(nèi)源性或外源性的刺激引起NLRP3炎癥小體活化[14]。NLRP3炎癥小體的活化調(diào)節(jié)著炎癥因子IL-1β及IL-18的成熟及分泌[15]。在NLRP3敲除的小鼠中，脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷改變明顯減輕[16]。NLRP3基因敲除可以降低capase-1的活化及體內(nèi)IL-1β的水平[17]。在IL-18基因敲除小鼠，急性肺損傷也明顯好轉(zhuǎn)[3]。本實驗中，LPS注射后4 h，ARDS組小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達顯著升高，給予利拉魯肽后ARDS小鼠上述指標mRNA表達明顯降低，說明利拉魯肽可能是通過 抑制NLRP3炎癥小體活化，進而抑制促炎細胞因子IL-1β及IL-18的合成及釋放，從而改善膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠肺損傷。

綜上所述，利拉魯肽作為一種常用的糖尿病治療藥物，其不良反應(yīng)少、安全性高。本研究采用利拉魯肽對ARDS小鼠進行干預(yù)，小鼠肺組織損傷明顯改善，說明利拉魯肽通過抑制炎癥小體的活化，拮抗炎性反應(yīng)對ARDS小鼠發(fā)揮保護作用。