張微微， 陳紫薇， 張曉娟， 竇文芳， 張曉梅， 耿 燕， 許正宏*，2

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

L-瓜氨酸是一種重要的非必需氨基酸，是尿素循環(huán)過程中的重要中間體[1]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及化妝品領(lǐng)域[2]。目前，L-瓜氨酸的主要生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法[3]、酶法[4]和微生物發(fā)酵法[5]。其中，微生物發(fā)酵法利用可再生糖質(zhì)原料生產(chǎn)瓜氨酸，具有成本低、產(chǎn)率高以及環(huán)境污染小等優(yōu)勢，近年來引起了廣泛的關(guān)注。

在谷氨酸棒桿菌中，L-瓜氨酸的合成是以α-酮戊二酸為前體，經(jīng)谷氨酸脫氫酶（gdh編碼）催化生成L-谷氨酸，L-谷氨酸進(jìn)一步在argCJBDFR編碼酶的作用下合成L-瓜氨酸，然而L-瓜氨酸易被argGH編碼酶分解為L-精氨酸，造成L-瓜氨酸在微生物體內(nèi)無法大量積累，見圖1。在該途徑中，L-瓜氨酸合成和分解途徑的調(diào)控基因argCJBDFR和argGH為兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，受到不同啟動子的調(diào)控[6]。Hao N 等[7]在 C.glutamicum ATCC 13032 ΔargG ΔargR中過表達(dá)argJ基因，增強(qiáng)了鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，成功使L-瓜氨酸產(chǎn)量提高到了8.51 g/L；趙芹芹等[8]在C.crenatum SYPA 5-5中敲除了argG基因，L-瓜氨酸的產(chǎn)量達(dá)到15.2 g/L；Ikeda M等[5]利用反向代謝工程方法，通過在C.glutamicum ATCC13032中敲除argR，并引入A26V和M31V突變獲得L-瓜氨酸生產(chǎn)菌株?？傮w而言，大多數(shù)研究主要通過敲除分解途徑編碼基因或外源質(zhì)粒過表達(dá)合成途徑關(guān)鍵基因兩種策略提高L-瓜氨酸的產(chǎn)量，然而上述方法存在容易形成營養(yǎng)缺陷型菌株，外源質(zhì)粒表達(dá)不穩(wěn)定等缺陷。

實(shí)驗(yàn)室前期保存的菌株C.crenatum H-7具有高產(chǎn)L-精氨酸的特性，該菌株與C.glutamicum具有高度同源性[9]。作者以C.crenatum H-7為研究對象，通過啟動子替換手段，弱化L-瓜氨酸分解成L-精氨酸的關(guān)鍵基因argGH的表達(dá)，最終獲得了一株能夠高效積累L-瓜氨酸的重組菌株。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 本研究所用的菌株與載體見表1。

圖1 谷氨酸棒桿菌中L-瓜氨酸的合成途徑Fig.1 Metabolic pathway of L-citrulline in Corynebacterium glutamicum

表1 文中涉及的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1）LB培養(yǎng)基（組分g/L）：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10；

2）LBG培養(yǎng)基（組分g/L）：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，葡萄糖 5；

3） LBHIS 培養(yǎng)基（組分 g/L）：酵母膏 2.5，蛋白胨 5，NaCl 5，腦心浸液 18.5，山梨醇 91；

4）感受態(tài)制備（組分g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，甘氨酸 30，吐溫 80；

5）種子培養(yǎng)基（組分 g/L）：葡萄糖 30，酵母粉10，（NH4）2SO420，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5， 尿素1.5；pH 7.0；115 ℃滅菌 10 min；

6）發(fā)酵培養(yǎng)基（組分g/L）：葡萄糖130，酵母粉10， （NH4）2SO450，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，生物素 8×10-5，L-組氨酸 5×10-4，CaCO330；pH7.0；115 ℃滅菌 10min。

大腸桿菌于37℃培養(yǎng)，必要時(shí)添加50 mg/mL的卡那霉素；鈍齒棒桿菌于30℃培養(yǎng)，必要時(shí)添加50 mg/mL的卡那霉素。

1.1.3 引物 本研究所用的引物見表2。

表2 文中所用到的引物Table 2 Primers used in this study

1.2 攜帶啟動子片段的重組質(zhì)粒構(gòu)建

以C.crenatum H-7基因組為模板，分別以PargC-F、PargC-R 和 PargG-F、PargG-R 為上下游引物擴(kuò)增argC和argG上游長度約160 bp和180 bp的目標(biāo)啟動子片段，啟動子片段P-dapAB6、P-leuAM2A和P-leuAM3A（長度均為130 bp）由上海生工進(jìn)行合成。利用限制性內(nèi)切酶BamHI和Hind III對啟動子探針質(zhì)粒pDXW-11[10]進(jìn)行酶切，利用T4 DNA ligase連接啟動子片段和酶切后的質(zhì)粒pDXW-11，形成攜帶不同啟動子的重組質(zhì)粒。

1.3 啟動子替換重組質(zhì)粒pK18mobsacBPdapAB6:argGH的構(gòu)建

啟動子替換質(zhì)粒pK18mobsacB-PdapAB6：argGH的構(gòu)建流程見圖2。首先，以C.crenatum H-7的基因組為模板，分別擴(kuò)增argG基因上游長度約600 bp和argG基因開放閱讀框長度約700 bp的基因片段，弱啟動子片段P-dapAB6（130 bp）通過基因合成得到，利用重疊延伸PCR，獲得長度約1 430 bp的啟動子替換片段argG-LPR；然后利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xba I對目的片段和質(zhì)粒pK18mobsacB[11]進(jìn)行雙酶切，形成具有粘性末端的線性片段；最后，利用T4 DNA ligase連接argG-LPR和線性化的pK18mobsacB質(zhì)粒，形成啟動子替換重組質(zhì)粒 pK18mobsacB-PdapAB6：argGH。

圖2 重組質(zhì)粒pK18mobsacB-PdapAB6:argGH的構(gòu)建流程Fig.2 Construction of plasmid pK18mobsacB-PdapAB6:argGH

1.4 重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化

C.crenatum感受態(tài)細(xì)胞的制備和電轉(zhuǎn)化參考文獻(xiàn)[12]方法。將重組質(zhì)粒pK18mobsacB-PdapAB6：argGH電轉(zhuǎn)化C.crenatum感受態(tài)細(xì)胞，然后在含卡那霉素抗性的LBHIS平板和含10%蔗糖的LB平板上進(jìn)行兩次篩選，通過PCR驗(yàn)證獲得重組菌株C.crenatum H-7-PdapAB6：argGH。

1.5 L-瓜氨酸發(fā)酵條件及參數(shù)測定

1.5.1 種子培養(yǎng)條件 將保存于-20℃冰箱中的甘油管菌種接種于新鮮固體種子斜面，30℃靜置培養(yǎng)24 h；將活化后的菌種接入種子培養(yǎng)基 （裝液量為30 mL/250 mL三角瓶），120 r/min、30℃往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)10 h。

1.5.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件 以6%的接種體積分?jǐn)?shù)將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基（裝液量為20 mL/250 mL三角瓶），120 r/min、30℃往復(fù)式振蕩培養(yǎng)96 h。

1.5.3 菌體濃度的測定 將發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)，在562 nm處測定吸光值。

1.5.4 葡萄糖質(zhì)量濃度的測定 將樣品稀釋一定倍數(shù)，利用SBA-40D生物傳感分析儀進(jìn)行測定。

1.5.5 （NH4）2SO4質(zhì)量濃度的測定 將樣品稀釋一定倍數(shù)，測定方法參考Lee H[13]。

1.5.6 L-瓜氨酸質(zhì)量濃度的測定 將發(fā)酵液上清液稀釋一定倍數(shù)，以異硫氰酸苯酯（PITC）作為衍生化試劑進(jìn)行氨基酸柱前衍生，利用HPLC進(jìn)行氨基酸質(zhì)量濃度的測定。

1.6 啟動子活性分析

將含有不同啟動子片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli JM109，以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT的酶活來表示啟動子活性。取培養(yǎng)約16 h的含啟動子探針質(zhì)粒的重組菌發(fā)酵液進(jìn)行離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.8）洗滌三次，懸浮。 超聲波破碎細(xì)胞，離心，取上清液用于氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT酶活測定，以攜帶空質(zhì)粒的E.coli JM109為對照。采用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度[14]，CAT酶活測定參照文獻(xiàn)[15]的方法。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

選擇培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期的原始菌株H-7以及重組菌株H-7-PdapAB6：argGH種子培養(yǎng)液，參照RNA提取試劑盒說明書提取樣品中的總RNA，選擇A260/280比值約為2.0的產(chǎn)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。RT-PCR實(shí)驗(yàn)按PrimerScriptTM RT reagent Kit（Takara）試劑盒說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)條件為95℃3 min，隨后3步反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s。選用 16SrRNA作為內(nèi)參基因，所有反應(yīng)設(shè)定3個(gè)重復(fù)。

1.8 酶活測定

1.8.1 谷氨酸脫氫酶 （GDH）酶活力測定 谷氨酸脫氫酶酶活力單位定義為每分鐘氧化 1 μmol NADPH所需要的酶量，方法參照Meers J L[16]。

1.8.2 精胺琥珀酸合成酶 （ASS）酶活力測定 精胺琥珀酸合成酶酶活力單位定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol Pi所需要的酶量，方法參照Katewa S D[17]。

1.8.3 精胺琥珀酸裂解酶酶（ASL）酶活力測定 精胺琥珀酸裂解酶酶活力單位定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol L-精氨酸所需要的酶量，方法參照Lee H[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動子活性分析

鈍齒棒桿菌以谷氨酸為前體，在argCJBDFR編碼酶的作用下合成L-瓜氨酸，而L-瓜氨酸能在argGH編碼酶的催化下繼續(xù)分解。整個(gè)過程中，argCJBDFR和argGH分別受到不同啟動子的調(diào)控。以C.crenatum H-7染色體DNA為模板，用表2中引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到啟動子片段P-argC和P-argG。在利用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)纈氨酸[18]和腐胺[19]的報(bào)道中，成功利用弱啟動子P-dapAB6、P-leuAM2C和P-leuAM3A對代謝流進(jìn)行了調(diào)控，作者同時(shí)選用這3個(gè)弱啟動子進(jìn)行了研究。將啟動子片段插入到啟動子探針質(zhì)粒pDXW-11上，構(gòu)建了攜帶啟動子片段的重組質(zhì)粒pDXW-11-P-argC、pDXW-11-P-argG、pDXW-11-P-dapAB6、pDXW-11-P-leuAM2C和pDXW-11-P-leuAM3C，將其轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中用于啟動子活性分析。

通過測定氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT的酶活來表征啟動子活性，結(jié)果見表3。CAT酶活測定結(jié)果顯示，L-瓜氨酸合成途徑調(diào)控argCJBDFR表達(dá)的啟動子P-argC活性為25.12 U/mg，而分解途徑調(diào)控argGH表達(dá)的啟動子P-argG活性為6.97 U/mg，表明仍有大量L-瓜氨酸被分解形成L-精氨酸。因此，我們選擇活性最弱的啟動子P-dapAB6（1.21 U/mg）替換C.crenatum H-7基因組上的啟動子P-argG，以期最大程度弱化降解途徑，提高L-瓜氨酸積累。

表3 通過氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）酶活測定的啟動子活性Table 3 Promoters activity characterized by the activity of CAT reporter

2.2 啟動子替換重組菌株H-7-PdapAB6:argGH的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pK18mobsacB-PdapAB6：argGH電轉(zhuǎn)到C.crenatum H-7感受態(tài)細(xì)胞中，會發(fā)生兩次同源重組，將重組菌涂布于含卡那霉素的LBHIS平板和含10 g/dL蔗糖的LB平板上進(jìn)行兩輪篩選。以篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子基因組為模板，用引物PsodargG1F和Psod-argG6R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖3。1號通道為以原始菌株基因組為模板PCR驗(yàn)證結(jié)果，條帶大小為1 300 bp，2號通道為以重組菌株H-7-PdapAB6：argGH基因組為模板PCR驗(yàn)證結(jié)果，條帶大小為1 430 bp，這表明P-dapAB6弱啟動子替換成功，C.crenatum H-7-PdapAB6：argGH重組菌株構(gòu)建完成。

圖3 啟動子替換PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 PCR verification of promoter replacement in H-7 chromosome

2.3 啟動子弱化對H-7-PdapAB6:argGH胞內(nèi)關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平和關(guān)鍵酶活性的影響

重組菌株H-7-PdapAB6：argGH和原始菌株H-7代謝途徑中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平比較見圖4?？梢钥闯觯亟M菌株H-7-PdapAB6：argGH分解途徑基因argG和argH的轉(zhuǎn)錄水平分別降低了86.23%和90.74%，L-瓜氨酸合成途徑基因的轉(zhuǎn)錄水平普遍上調(diào)，其中g(shù)dh的轉(zhuǎn)錄水平提高了2.09倍。

圖4 關(guān)鍵基因的相對轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.4 Relative transcription level of the key genes determined by RT-PCR

對轉(zhuǎn)錄水平有顯著差異的3個(gè)關(guān)鍵酶的酶活進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。相比原始菌株H-7，重組菌株H-7-PdapAB6：argGH合成途徑谷氨酸脫氫酶（GDH）的比酶活提高了67.05%，分解途徑中精胺琥珀酸合成酶（ASS）和精胺琥珀酸裂解酶（ASL）的比酶活分別降低了91.80%和55.35%。上述結(jié)果表明，啟動子替換顯著弱化了L-瓜氨酸的分解途徑，且合成途徑得到一定程度的加強(qiáng)。

表4 GDH，ASS，ASL比酶活測定Table 4 Specific activity of GDH，ASS and ASL

2.4 重組菌株H-7-PdapAB6:argGH發(fā)酵過程分析

在搖瓶水平上對重組菌株H-7-PdapAB6：argGH的L-瓜氨酸生產(chǎn)性能進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果見圖5-6。1）96 h發(fā)酵結(jié)束時(shí)，重組菌株H-7-PdapAB6：argGH的生物量達(dá)到32.17 g/L，比原始菌株H-7的生物量（26.32 g/L）提高了 22.22%，H-7-PdapAB6：argGH的最大及平均比生長速率分別為0.44 h-1和0.048 h-1，均高于原始菌株（分別為0.27 h-1和0.037 h-1）；2） 相比原始菌株 H-7， 發(fā)酵前期 H-7-PdapAB6：argGH的葡萄糖消耗速率顯著降低，H-7 84 h時(shí)葡萄糖已經(jīng)耗盡，而重組菌株直到發(fā)酵終止時(shí)葡萄糖才消耗完全。重組菌株H-7-PdapAB6：argGH的最大及平均比底物消耗速率分別為0.16 g/（g·h）和 0.085 g/（g·h），低于原始菌株 H-7（分別為 0.36 g（g·h）和 0.11 g/（g·h））；3） 重組菌株H-7-PdapAB6：argGH的L-瓜氨酸的產(chǎn)量可以達(dá)到33.85 g/L，相比原始菌株H-7（6.90 g/L）提高了4.91倍，L-瓜氨酸的糖酸轉(zhuǎn)化率 （0.25 g/g）和生產(chǎn)強(qiáng)度（0.34 g/（L·h）） 分別提高了 5.00 倍和 4.86 倍，最大及平均比產(chǎn)物得率也得到了提高；4）相比原始菌株H-7主要積累L-精氨酸，重組菌株H-7-PdapAB6：argGH L-精氨酸只有少量積累。

3 結(jié)語

啟動子在基因表達(dá)過程中具有重要作用，決定了基因表達(dá)的時(shí)間強(qiáng)度，是必需的順式調(diào)控元件[20]，通過啟動子調(diào)控和改變基因表達(dá)水平，已成功應(yīng)用于賴氨酸[21]、纈氨酸[18]和精氨酸[22]等生產(chǎn)菌株的改造中，該方法有效地改變了代謝流分布，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)產(chǎn)物的高產(chǎn)。然而，此方法在瓜氨酸的研究中還未見相關(guān)報(bào)道。

圖5 原始菌株H-7和重組菌株H-7-PdapAB6:argGH的發(fā)酵過程曲線Fig.5 Time course of L-citrulline fermentation by the parent strain H-7 and the engineered strain H-7-PdapAB6:argGH

圖6 原始菌株H-7和重組菌株H-7-PdapAB6:argGH的發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)圖Fig.6 Fermentation kinetics of the parent strain H-7 and the engineered strain H-7-PdapAB6:argGH

作者通過分析L-瓜氨酸分解途徑中調(diào)控argGH表達(dá)的啟動子P-argG，發(fā)現(xiàn)催化瓜氨酸分解為精氨酸的P-argG具有較強(qiáng)的活性，造成瓜氨酸無法大量積累。因此，作者采用啟動子替換手段，利用啟動子P-dapAB6[19]調(diào)控argGH的表達(dá)，弱化瓜氨酸的分解途徑，成功構(gòu)建了一株L-瓜氨酸高產(chǎn)菌株 C.crenatum H-7-PdapAB6：argGH。重組菌株H-7-PdapAB6：argGH L-瓜氨酸合成途徑關(guān)鍵基因和關(guān)鍵酶的表達(dá)水平分析結(jié)果表明，L-瓜氨酸分解代謝途徑基因argGH表達(dá)水平降低，ASS和ASL酶活大幅度下降，L-瓜氨酸的分解代謝流明顯弱化，但調(diào)控α-酮戊二酸進(jìn)入L-瓜氨酸合成途徑的基因gdh表達(dá)水平和GDH酶活水平顯著提高，因此提高了TCA循環(huán)到L-瓜氨酸合成途徑的代謝流量。發(fā)酵結(jié)果表明，重組菌株H-7-PdapAB6：argGH L-瓜氨酸的產(chǎn)量，糖酸轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到33.85 g/L、0.25 g/g 和 0.34 g/（L·h），比原始菌株 H-7 提高了4.91倍、5.00倍和 4.86倍。 該菌株與 VF Wendisch等[23]報(bào)道相比，發(fā)酵過程中無需外源添加抗生素和精氨酸，且L-瓜氨酸的生產(chǎn)性能得到大幅提升，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。