付嬌嬌 ， 王 旭 ， 劉海泉 ， 孫曉紅 ， 謝 晶 ， 潘迎捷 ， 趙 勇 *

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是重要的革蘭氏陽(yáng)性食源性致病菌，可引發(fā)敗血癥、胃腸炎和腦膜炎等疾病，被WHO列為關(guān)系食品衛(wèi)生安全的重要病源細(xì)菌之一[1]。單增李斯特菌在自然界廣泛分布，能在多數(shù)固體表面形成生物被膜。細(xì)菌生物被膜（Bacterial biofilm，BF）是細(xì)菌自身分泌的胞外基質(zhì)相互粘連形成的，有特定結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞群體[2-3]。自然界中大多數(shù)的細(xì)菌是以生物被膜狀態(tài)存在的，細(xì)菌處于生物被膜狀態(tài)可增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)外界不利條件如干燥、極端的溫度、抗菌素和消毒劑的抵抗力[4]。因此，在食品生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和保藏過(guò)程中，一旦發(fā)生細(xì)菌感染并形成生物被膜，常規(guī)殺菌方法便難以將其徹底清除，這給食品安全造成極大的隱患?？梢?jiàn)，尋找如何有效預(yù)防和控制食品產(chǎn)業(yè)中細(xì)菌生物被膜形成的方法已刻不容緩。乳酸鈉作為一種天然、無(wú)毒、穩(wěn)定的食品防腐劑，在肉類(lèi)工業(yè)中廣泛應(yīng)用，正越來(lái)越受到食品產(chǎn)業(yè)的重視[5]。研究表明，乳酸鈉對(duì)肉及肉類(lèi)食品中常見(jiàn)腐敗菌和致病菌有較強(qiáng)的抑制作用，以延長(zhǎng)食品貨架期[6]。然而，關(guān)于研究乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌生物被膜形成的抑制作用尚未見(jiàn)報(bào)道。作者采用結(jié)晶紫染色法體外觀察不同質(zhì)量濃度（0、2.5、5、10、20 g/dL）乳酸鈉對(duì)生物被膜形成的抑制效果，此外，使用實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)與單增李斯特菌生物被膜形成相關(guān)基因（motB、mogR、degU、flgE、dnaK、prfA 及 sigB）的表達(dá)水平，從而探究乳酸鈉對(duì)生物被膜形成的抑制作用。本研究為乳酸鈉應(yīng)用于單增李斯特菌生物被膜的預(yù)防和控制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌株 單增李斯特菌野生型菌株WaX12由作者所在實(shí)驗(yàn)室于生豬肉中分離而得，血清型為1/2a，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)分析、生化特性以及分子生物學(xué)鑒定，由上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑和儀器 戊二醛、結(jié)晶紫、無(wú)水乙醇、磷酸緩沖液（PBS）及98%濃硫酸：均購(gòu)自上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；氯化鉀：購(gòu)自天津市鼎盛鑫化工有限公司；苯酚：購(gòu)自上海展云化工有限公司；福林-酚、lowry reagent：均購(gòu)自 Sigma 公司；MTT染料、碘化丙啶PI染料及SYBR GreenⅠ染料：均購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司；腦心浸液培養(yǎng)基（BHI培養(yǎng)基）、PALCAM培養(yǎng)基：均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；24孔板、96孔微孔板：均購(gòu)自Corning公司；動(dòng)物總RNA快速提取試劑盒（Trizol-離心柱型）：購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）：購(gòu)自麥約爾生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptTM RT Reagent Kit，日本TakaRa公司；BioTeK酶標(biāo)儀：美國(guó)柏騰儀器有限公司；離心機(jī)、金屬浴、PCR擴(kuò)增儀：美國(guó)Eppendorf公司；振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；JYP2-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；LSM710型激光掃描共聚焦顯微鏡：德國(guó)蔡司公司；NOVA NanoSEM230型超高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡UHR FE-SEM：美國(guó)FEI公司；E-1045型離子濺射儀 Ion Sputter：日本Hitachi公司；7500 Fast Real-Time PCR System擴(kuò)增儀：美國(guó)Applied Biosystems公司；BD FASSCalibur流式細(xì)胞儀：美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 生物被膜的形成與測(cè)定 參照文獻(xiàn)[7]的方法并稍作改進(jìn)。具體步驟：將WaX12菌株在PALCAM選擇性培養(yǎng)基平板上劃線，37℃靜置過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落至5 mL BHI液體培養(yǎng)基于37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7～8 h至OD600nm為0.6左右。配制終質(zhì)量濃度分別為 0、2.5、5、10、20 g/dL 乳酸鈉的BHI培養(yǎng)基，將菌懸液與培養(yǎng)基按體積比1∶99（將10 μL 菌懸液接種于 990 μL 培養(yǎng)基）， 按 1 mL/孔加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，測(cè)定培養(yǎng)48 h形成的生物被膜。24孔板用封口膜封口，防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。設(shè)3個(gè)平行樣，以無(wú)菌BHI為空白對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后，小心棄去孔中的培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌3次，以除去尚未形成生物被膜的浮游菌體。室溫干燥45 min后，向每個(gè)樣品孔內(nèi)加入1 mL 0.1%結(jié)晶紫溶液，染色30 min。染色結(jié)束后，用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌3次。室溫風(fēng)干后，加入1 mL 95%的乙醇溶液脫色30 min，移取200 μL洗脫液于96孔微孔板，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)生物被膜菌的光吸收值（OD600nm）。不同濃度乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜形成的抑制率計(jì)算公式：

其中，CV（Cristal violet staining）為結(jié)晶紫染色法定量生物被膜的形成量，對(duì)照為不添加乳酸鈉，x為乳酸鈉的質(zhì)量濃度。

1.2.2 胞外多糖 （Polysaccharide）及胞外蛋白質(zhì)（Extracellular protein）的測(cè)定 菌株按1.2.1培養(yǎng)，測(cè)定WaX12菌株在37℃條件下培養(yǎng)48 h的生物被膜胞外多糖及胞外蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。參照文獻(xiàn)[8]方法并稍作改進(jìn)。具體步驟如下：培養(yǎng)結(jié)束后，首先用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液OD595nm的光吸收值。然后小心棄去孔中的培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌3次，以除去尚未形成生物被膜的浮游菌體。加入1 mL 0.01 mol/L的氯化鉀溶液重懸5 min，然后每個(gè)樣品孔超聲5 s，間隙5 s，循環(huán)5次。超聲結(jié)束后，將菌液轉(zhuǎn)移至1.5 mL無(wú)菌離心管內(nèi)，于4℃條件下，轉(zhuǎn)速為 4 000 g/min，離心 20 min。隨后用直徑 0.22 μm的濾膜過(guò)濾上清液，以除去雜質(zhì)。

胞外多糖的測(cè)定：吸取100 μL濾液于1.5 mL無(wú)菌離心管內(nèi)，加入200 μL 98%的濃硫酸，室溫靜置30 min。隨后加入25 μL 6%的苯酚溶液，置于90℃ 金屬浴中，溫育5 min。移取200 μL樣品于96孔微孔板內(nèi)，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD490nm的光吸收值，計(jì)算比值OD490nm/OD595nm即為樣品多糖相對(duì)含量。

胞外蛋白質(zhì)的測(cè)定：吸取40 μL濾液于1.5 mL無(wú)菌離心管內(nèi)，加入 200 μL lowry reagent溶液（lowry法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑），室溫靜置10 min。然后加入20 μL福林-酚溶液，室溫靜置30 min。移取200 μL樣品于96孔微孔板內(nèi)，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD750nm的光吸收值，計(jì)算比值OD750nm/OD595nm即為樣品胞外蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。

1.2.3 MTT法檢測(cè)生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞活性 配制終質(zhì)量濃度分別為0、5 g/dL乳酸鈉的BHI培養(yǎng)基，按1.2.1方法，于37℃下培養(yǎng)48 h形成的生物被膜。參照文獻(xiàn)[9]方法并稍作改進(jìn)。具體步驟如下：先將形成的生物被膜經(jīng)PBS洗滌3次，以去除未附著的細(xì)胞；加入1 mL新鮮BHI培養(yǎng)基和100 μL預(yù)先配制的終質(zhì)量濃度為5 mg/mL MTT染液，于37℃避光溫育1 h，然后在通風(fēng)櫥內(nèi)加入1 mL二甲基亞砜溶解沉淀30 min，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD570nm的光吸收值。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡 （Confoeal laser scanning microscopy，CLSM）觀察生物被膜結(jié)構(gòu) 配制終質(zhì)量濃度分別為0 g/dL和5 g/dL乳酸鈉的BHI培養(yǎng)基，按1.2.1方法，于37℃培養(yǎng)48 h形成的生物被膜，參照文獻(xiàn)[7]方法并稍作改進(jìn)。具體步驟如下：先將形成的生物被膜經(jīng)PBS洗滌3次，以去除未附著的細(xì)胞；再用4%戊二醛溶液固定30 min，PBS溶液洗滌3 次，然后用預(yù)先配制好的 SYBRGreenI（1：500000）染料于暗室中染色30 min，最后用PBS溶液洗滌3次，以除去多余的染料。立即取片，在CLSM下觀察。

1.2.5 掃描電鏡 （Scanning electron microscopy，SEM）觀察生物被膜結(jié)構(gòu) 配制終質(zhì)量濃度分別為0 g/dL和5 g/dL乳酸鈉的BHI培養(yǎng)基，按1.2.1方法，于37℃下培養(yǎng)48 h形成生物被膜，參照文獻(xiàn)[7]方法并稍作改進(jìn)。具體步驟如下：先將形成的生物被膜經(jīng)PBS洗滌3次，以去除未附著的細(xì)胞；再用4%戊二醛溶液固定2 h。固定結(jié)束后，分別用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%、100%無(wú)水乙醇進(jìn)行梯度脫水 （30%、50%、70%、90%無(wú)水乙醇依次脫水一次，每次10 min，100% 無(wú)水乙醇脫水2次），于室溫下過(guò)夜干燥，在SEM下觀察。

1.2.6 流式細(xì)胞儀（Flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性 配制終質(zhì)量濃度分別為0 g/dL和5 g/dL乳酸鈉的BHI培養(yǎng)基，按1.2.1方法，于37℃下培養(yǎng)48 h形成的生物被膜。參照文獻(xiàn)[7]方法并稍作改進(jìn)。具體步驟如下：先收集生物被膜菌體，用PBS洗滌一次，加入預(yù)冷的70%乙醇固定，置于4℃下固定2 h。離心棄去固定液，然后用PBS重懸5 min。重懸結(jié)束后，使用400目的篩網(wǎng)過(guò)濾一次，之后離心5 min，轉(zhuǎn)速為1 000 r/min，棄去PBS。最后加入終質(zhì)量濃度為10 μg/mL的PI染液，置于4℃條件下避光染色30 min。染色結(jié)束后，立即使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。使用FlowJo 7.6軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析所得Mean值即為熒光信號(hào)強(qiáng)度。

1.2.7 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄cDNA 菌體收集：按1.2.1方法，分別收集WaX12菌株于37℃培養(yǎng)48 h的浮游態(tài)菌體和生物被膜態(tài)菌體，用于總RNA的提取。RNA提取與反轉(zhuǎn)錄cDNA：利用動(dòng)物總RNA快速提取試劑盒（Trizol-離心柱型）試劑盒操作步驟提取總RNA，貯存在-80℃冰箱。RNA的濃度采用BioTek酶標(biāo)儀測(cè)定，完整性通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。每個(gè)樣品中200 ng總RNA用于反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，產(chǎn)物cDNA置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR） 選擇了與鞭毛合成及運(yùn)動(dòng)相關(guān)的基因 flgE、motB、degU及mogR；主要毒力調(diào)控因子prfA、熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子dnaK[10]及主要壓力應(yīng)答因子sigB[11]。引物由上海生工生物有限公司合成，序列見(jiàn)表1。2-ΔΔCT方法用于比較不同樣本之間基因的表達(dá)量變化。Gap作為管家基因[12]。利用 FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）方法進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。應(yīng)用7500 Fast Real-Time PCR System擴(kuò)增儀操作。不含cDNA模板的體系作為陰性對(duì)照。做三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品做3個(gè)平行。

表1 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR基因引物序列Table 1 List of primer sequences used in qRT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0、SPSS17.0軟件處理，對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同質(zhì)量濃度乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜形成的影響

將不同質(zhì)量濃度的乳酸鈉（0、2.5、5、10、20 g/dL）處理單增李斯特菌WaX12，48 h后采用結(jié)晶紫法測(cè)定生物被膜的形成情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，相比于對(duì)照組，質(zhì)量濃度為2.5、5、10、20 g/dL的乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜的抑制率分別為 8.34%（p＜0.05）、32.2%（p＜0.01）、46.6%（p＜0.01）和55.2%（p＜0.01）。可見(jiàn)，乳酸鈉可有效抑制單增李斯特菌WaX12生物被膜的形成。

圖1 不同質(zhì)量濃度乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜形成的影響Fig.1 Effets of sodium lactate at different concentrations on L.monocytogenes biofilm formation

2.2 顯微鏡觀察乳酸鈉對(duì)單增李斯特WaX12生物被膜結(jié)構(gòu)的影響

為進(jìn)一步研究乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌生物被膜形成的抑制效果，選取5 g/dL乳酸鈉處理單增李斯特菌WaX12進(jìn)行后續(xù)研究。首先，利用CLSM與SEM觀察其在37℃下培養(yǎng)48 h后的生物被膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖2。觀察圖2（a）可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)5 g/dL乳酸鈉處理之后的生物被膜密度顯著降低。未經(jīng)乳酸鈉處理的對(duì)照組生物被膜的厚度為28.70 μm，而5%乳酸鈉處理組生物被膜的厚度顯著減少，降至15.19 μm。此外，進(jìn)一步通過(guò)SEM觀察WaX12菌株生物被膜的超顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組可形成立體且致密的成熟生物被膜結(jié)構(gòu)，而5 g/dL乳酸鈉處理組的生物被膜結(jié)構(gòu)明顯變稀疏，由小菌落相互交聯(lián)而成。以上結(jié)果表明，5 g/dL乳酸鈉可有效抑制單增李斯特菌WaX12生物被膜的形成，與上述結(jié)晶紫定量結(jié)果相一致。

圖2 顯微鏡觀察5 g/dL乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 CLSM and SEM images of biofilms formed by L.monocytogenes with 5%sodium lactate（right） and without（left）

2.3 乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜胞外多糖及胞外蛋白質(zhì)形成的影響

細(xì)菌在形成生物被膜的過(guò)程中，其分泌的胞外物質(zhì)主要為胞外多糖和胞外蛋白質(zhì)。這些胞外物質(zhì)不僅能增強(qiáng)微生物細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境因素的抵抗能力，而且在細(xì)胞初始粘附及維持生物被膜穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用。因此，研究了5 g/dL乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜胞外多糖及蛋白形成的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，經(jīng)5 g/dL乳酸鈉處理之后，胞外多糖及蛋白質(zhì)的相對(duì)含量均顯著降低（p＜0.01）；與對(duì)照組相比，胞外多糖的相對(duì)含量降低了33.9%，而胞外蛋白質(zhì)的相對(duì)含量降低了56.1%?？梢?jiàn)，乳酸鈉對(duì)胞外蛋白質(zhì)形成的抑制效果更明顯。綜上所述，乳酸鈉可有效抑制單增李斯特菌WaX12胞外物質(zhì)的形成，從而降低了其生物被膜的形成。

圖3 乳酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜胞外多糖及蛋白質(zhì)形成的影響Fig.3 Polysaccharidesand extracelluar proteinsin biofilm of WaX12 with 5%sodium lactate and without

2.4 乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞活性的影響

利用MTT法檢測(cè)5%乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。經(jīng)5 g/dL乳酸鈉處理之后，單增李斯特菌WaX12生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞活性顯著降低（p＜0.01），且抑制率達(dá)到56.4%，可進(jìn)一步表明其抑制WaX12菌株生物被膜形成的效果顯著。

圖4 乳酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞活性的影響Fig.4 Effects of sodium lactate on viable cells in biofilm of WaX12 with 5%sodium lactate and without

2.5 乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的影響

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)5 g/dL乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。經(jīng)5 g/dL乳酸鈉處理的WaX12菌株生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞PI信號(hào)峰發(fā)生右移，信號(hào)強(qiáng)度顯著增大（圖5（c））?？梢?jiàn)，乳酸鈉可顯著降低WaX12菌株生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，從而抑制其生物被膜的形成。

圖5 流式細(xì)胞儀分析乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig.5 Flow cytometry analysis of effects of Sodium lactate on membrane integrity of L.monocytogenes biofilm cells

2.6 乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌WaX12生物被膜相關(guān)基因表達(dá)量的影響

采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定了單增李斯特菌WaX12生物被膜相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，見(jiàn)圖6。從圖6可以看出，與對(duì)照組相比較，經(jīng)5 g/dL乳酸鈉處理過(guò)的生物被膜狀態(tài)下的WaX12菌株，一些與生物被膜相關(guān)的基因表達(dá)量下調(diào)，主要為鞭毛合成及運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因 motB、mogR、degU、flgE；熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子dnaK及主要毒力調(diào)控因子prfA。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，乳酸鈉可通過(guò)下調(diào)單增李斯特菌WaX12生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)以抑制其生物被膜的形成。

圖6 乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌WaX12的生物被膜相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of Sodium lactate on expression of biofilmassociated genes in L.monocytogenes WaX12 biofilm cells

3 結(jié)語(yǔ)

乳酸鈉作為一種常見(jiàn)防腐劑可抑制多種腐敗菌和致病菌的生長(zhǎng)，其在減少胴體污染、降低細(xì)菌總數(shù)方面具有明顯的效果[13]。細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境的一種生命現(xiàn)象，生物被膜態(tài)的細(xì)菌具有極強(qiáng)的抗藥性、抗吞噬及抗趨化作用，普通的清洗和消毒無(wú)法達(dá)到除菌的效果[14]。因此，如何控制食品產(chǎn)業(yè)中細(xì)菌生物被膜的形成變得尤為重要。目前，國(guó)內(nèi)外研究乳酸鈉對(duì)細(xì)菌生物被膜的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，尤其對(duì)乳酸鈉作用機(jī)理以及應(yīng)用方面仍有待研究。

單增李斯特菌易在食品加工材料表面聚集形成生物被膜，與浮游菌相比，其生物被膜內(nèi)細(xì)菌對(duì)外界的環(huán)境刺激敏感性顯著降低，尤其是對(duì)抗菌劑的敏感性[15]。早期研究發(fā)現(xiàn)，作為生物被膜骨架的EPS是微生物自身代謝產(chǎn)物，是構(gòu)成生物被膜三維結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因子[16-17]。胞外多糖及胞外蛋白質(zhì)在細(xì)胞初始粘附及維持生物被膜穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用，Sutherland[18]等研究混合菌屬生物被膜結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，只要存在能合成胞外多糖的微生物菌屬，就能形成成熟穩(wěn)定的生物被膜，而B(niǎo)randa[19]等研究表明，假單胞菌細(xì)胞結(jié)合型胞外蛋白CdrA可促進(jìn)更多的細(xì)胞與胞外多糖結(jié)合，從而加快其生物被膜的形成。作者研究了5 g/dL乳酸鈉對(duì)其生物被膜胞外多糖及胞外蛋白質(zhì)形成的影響，發(fā)現(xiàn)其相對(duì)含量分別降低了33.9%（p＜0.01）和 56.1%（p＜0.01）；同時(shí)，顯微鏡觀察結(jié)果表明，單增李斯特菌在該NaL質(zhì)量濃度處理下無(wú)法形成成熟穩(wěn)定的生物被膜結(jié)構(gòu)；與對(duì)照組相比，其生物被膜結(jié)構(gòu)明顯稀疏，由微菌落交聯(lián)而成，且厚度減少了47.1%（p＜0.01）。由上述結(jié)果可知，乳酸鈉能夠通過(guò)降低單增李斯特菌生物被膜胞外多糖和胞外蛋白質(zhì)的形成以抑制其新生物被膜的形成。根據(jù)本研究使用MTT法檢測(cè)單增李斯特菌生物被膜內(nèi)細(xì)菌的細(xì)胞活性，該方法能夠檢測(cè)到生物被膜深部較低密度細(xì)菌的活性，具有操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[20]。我們發(fā)現(xiàn)，5 g/dL乳酸鈉可顯著降低單增李斯特菌生物被膜內(nèi)細(xì)菌的細(xì)胞活性，其抑制率達(dá)到56.4%（p＜0.01），可見(jiàn)其對(duì)單增李斯特菌生物被膜形成的抑制效果顯著。利用流式細(xì)胞儀技術(shù)評(píng)價(jià)了該質(zhì)量濃度下的乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的影響。熒光染料PI（碘化丙啶）是一種可用于DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，雖然不能通過(guò)活細(xì)胞膜，但能穿過(guò)破損的細(xì)胞膜而對(duì)核染色[21]。結(jié)果顯示，經(jīng) 5 g/dL乳酸鈉處理的單增李斯特菌生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性顯著降低。根據(jù)上述結(jié)果可知，乳酸鈉可抑制膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞活性及破壞細(xì)胞膜的完整性，從而抑制新生物被膜的形成。

研究表明，細(xì)菌粘附貫穿在整個(gè)生物被膜系統(tǒng)的不同階段，菌體的粘附能力可能決定著生物被膜持續(xù)形成和發(fā)展的命運(yùn)[22]。Lemon[23]等研究發(fā)現(xiàn)，在單增李斯特菌細(xì)胞初始粘附階段，鞭毛運(yùn)動(dòng)對(duì)生物被膜的形成起著至關(guān)重要的作用。在研究乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌生物被膜相關(guān)基因表達(dá)量影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)5 g/dL乳酸鈉處理后，與鞭毛合成及運(yùn)動(dòng)相關(guān)的基因 motB、mogR、degU、flgE表達(dá)量均出現(xiàn)了下調(diào)。鞭毛的趨化運(yùn)動(dòng)可使浮游的單增李斯特菌向有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表面游動(dòng)，增強(qiáng)細(xì)菌與接觸表面的粘附性，從而有助于細(xì)菌形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的生物被膜[24]。近年來(lái)，研究主要毒力基因prfA在單增李斯特菌生物被膜形成過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制也是一大熱點(diǎn)，這對(duì)于揭示其致病原理具有重要的意義。目前，已有大量研究證明轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子prfA是正向調(diào)控單增李斯特菌生物被膜形成的因子之一，并且發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌的絕大多數(shù)毒力基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)都受到prfA的調(diào)控[25]。張強(qiáng)等[26]通過(guò)比較野生型菌株EGD、prfA基因突變型菌株生物被膜形成能力的差異，發(fā)現(xiàn)與EGD株相比，prfA基因突變型菌株形成生物被膜的能力明顯降低。相比于對(duì)照組，我們發(fā)現(xiàn)5%乳酸鈉可顯著降低毒力基因prfA的表達(dá)水平。此外，已有研究表明,熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子dnaK也可促進(jìn)單增李斯特菌生物被膜的形成；同樣，經(jīng)5 g/dL乳酸鈉處理之后，其表達(dá)量顯著降低。綜上所述，我們推測(cè)乳酸鈉可能通過(guò)下調(diào)這些與生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)，從而在一定程度上抑制生物被膜的形成，但其具體的抑制機(jī)理仍需進(jìn)一步的研究。

本研究首先采用結(jié)晶紫染色法考察了不同濃度（0、2.5、5、10、20 g/dL）乳酸鈉對(duì)單增李斯特菌生物被膜形成的抑制效果，發(fā)現(xiàn)其抑制率分別為8.34%、32.2%、46.6%、55.2%。進(jìn)一步研究5 g/dL乳酸鈉抑制單增李斯特菌生物被膜形成的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)5 g/dL乳酸鈉處理后，單增李斯特菌生物被膜結(jié)構(gòu)明顯稀疏，且厚度減少；該質(zhì)量濃度下的乳酸鈉可顯著降低生物被膜胞外多糖和胞外蛋白質(zhì)的形成，同時(shí)抑制膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞活性及降低細(xì)胞膜的完整性。最后，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，乳酸鈉可通過(guò)下調(diào)單增李斯特菌生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)以抑制其生物被膜的形成。乳酸鈉作為常用防腐劑以有效抑制單增李斯特菌生物被膜的形成，具有極高的潛在應(yīng)用價(jià)值。