趙麗穎 李慧霞 張紅梅

急性白血病(acute leukemia，AL)是造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病，可分為急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)和急性髓細(xì)胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)，ALL常見于兒童，是兒童最常見的惡性腫瘤[1]。ALL病因復(fù)雜尚未完全清楚，近年來隨著聯(lián)合化療技術(shù)和造血干細(xì)胞移植技術(shù)發(fā)展應(yīng)用，兒童ALL誘導(dǎo)緩解率大大提高，存活率顯著改善，但仍有20%左右緩解患兒發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓等復(fù)發(fā)，威脅患兒生命健康[2]。因此，進(jìn)一步探究ALL的發(fā)病機(jī)制，發(fā)掘新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點非常關(guān)鍵。miRNA作為一類小的非編碼RNA調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)，在白血病發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮重要作用[3]。研究表明，miRNAs在造血干細(xì)胞自我更新、衰老及向惡性肝細(xì)胞轉(zhuǎn)變等過程中參與調(diào)控細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及表觀遺傳機(jī)制，是白血病干細(xì)胞的重要調(diào)控因子[4]。本研究通過檢測ALL患兒血清中miR-17、miR-29c表達(dá)水平，分析miR-17、miR-29c表達(dá)與患兒臨床指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系，旨在探討miR-17、miR-29c在ALL進(jìn)展中的臨床意義。

資料與方法

1.一般資料:選擇2010年9月～2013年2月在筆者醫(yī)院初診為ALL并住院治療的43例患兒作為研究對象，其中男性26例，女性17例，患兒年齡1～14歲，平均年齡5.69±1.24歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床病理特征、細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)等檢查符合《WHO造血與淋巴組織腫瘤分類(2016)》中急性白血病分類及診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②均為初診，患兒家屬知情并簽署同意書；③臨床資料完整便于預(yù)后判斷；④經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①確診前未進(jìn)行相關(guān)治療；②合并其他組織惡性腫瘤；③合并嚴(yán)重慢性消耗性疾??；④依從性差及不方便隨訪；⑤合并全身其他疾病患者。另選同時期體檢健康兒童40例作為對照組，其中男性22例，女性18例，年齡1～15歲，平均年齡6.14±1.37歲。兩組兒童性別、年齡等一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.治療方法：患兒全身化療采用CCLG-2008方案，化療分為誘導(dǎo)緩解、早期強(qiáng)化、鞏固治療、延遲強(qiáng)化、維持治療5個階段。療效標(biāo)準(zhǔn)：①誘導(dǎo)緩解：誘導(dǎo)化療35天，患兒貧血、出血等臨床癥狀消失，白細(xì)胞(white blood cell，WBC)計數(shù)和血小板計數(shù)恢復(fù)正常，紅細(xì)胞系及巨核細(xì)胞系正常，骨髓中早幼粒細(xì)胞及原粒細(xì)胞之和≤5%；②復(fù)發(fā)：誘導(dǎo)緩解后，骨髓中早幼粒細(xì)胞+原粒細(xì)胞>20%，或骨髓外、腦脊液中發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞浸潤。每例患兒隨訪0～5年。

3.觀察指標(biāo):所有ALL患兒在入院當(dāng)日抽取肘靜脈血4ml，對照組兒童體檢當(dāng)日抽取肘靜脈血4ml。采用試劑盒法提取血清總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，以U6為內(nèi)參，RT-PCR檢測兩組兒童血清中miR-17、miR-29c相對表達(dá)量。實驗用RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR試劑盒均購于天根生化科技(北京)有限公司，操作方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

結(jié) 果

1.兩組血清miR-17、miR-29c表達(dá)水平:病例組兒童血清中miR-17相對表達(dá)量高于對照組，miR-29c相對表達(dá)量低于對照組，兩組兒童血清中miR-17、miR-29c相對表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1和圖1。

表1 兩組兒童血清miR-17、miR-29c表達(dá)水平

圖1 兩組兒童血清miR-17、miR-29c相對表達(dá)量A.miR-17;B.miR-29

2.miR-17、miR-29c與ALL患兒臨床指標(biāo)的關(guān)系:初診WBC計數(shù)≥50×109/L患兒血清中miR-17表達(dá)水平顯著高于初診WBC計數(shù)<50×109/L患兒(P<0.05)，miR-29c表達(dá)水平顯著低于初診WBC計數(shù)<50×109/L患兒(P<0.05)；B-ALL患兒血清中miR-17表達(dá)水平顯著低于T-ALL患兒(P<0.05)，miR-29c表達(dá)水平顯著高于T-ALL患兒(P<0.05)；潑尼松誘導(dǎo)敏感患兒血清miR-29c表達(dá)水平顯著高于不敏感患兒(P<0.05)；患兒血清miR-17表達(dá)水平與性別、年齡、染色體異常及潑尼松誘導(dǎo)敏感度無關(guān)(P>0.05)，miR-29c表達(dá)水平與性別、年齡、染色體異常無關(guān)(P>0.05),詳見表2。

表2 miR-17、miR-29c與ALL患兒臨床指標(biāo)的關(guān)系

3.不同預(yù)后患兒血清miR-17、miR-29c表達(dá)水平:ALL患兒治療過程中死亡4例，治療后，誘導(dǎo)緩解39例，誘導(dǎo)緩解率90.70%，其中復(fù)發(fā)17例，復(fù)發(fā)率43.58%。誘導(dǎo)緩解后死亡8例，生存31例，5年總生存率72.09%，其中無事件生存22例，無事件生存率51.16%。生存組患兒血清miR-17相對表達(dá)量顯著低于死亡組患兒(P<0.05)，miR-29c相對表達(dá)量顯著高于死亡組患兒(P<0.05),詳見表3和圖2。

表3 不同預(yù)后患兒血清miR-17、miR-29c表達(dá)水平

圖2 不同預(yù)后患兒血清miR-17、miR-29c相對表達(dá)量

4.血清miR-17、miR-29c與患兒生存率的關(guān)系:根據(jù)患兒血清miR-17表達(dá)中位值2.45，將43例患兒分為兩組：miR-17高表達(dá)組(≥2.45)20例，miR-17低表達(dá)組(<2.45)23例。miR-17高表達(dá)組患兒5年無事件生存率30%顯著低于miR-17低表達(dá)組患兒69.57%(P<0.05)，5年總生存率55%顯著低于miR-17低表達(dá)組患兒86.96%(P<0.05)；根據(jù)患兒血清miR-29c表達(dá)中位值1.25，將患兒分為兩組：miR-29c高表達(dá)組(≥1.25)19例，miR-29c低表達(dá)組(<1.25)24例。miR-29c高表達(dá)組患兒5年無事件生存率73.68%顯著高于miR-29c低表達(dá)組患兒33.33%(P<0.05)，5年總生存率94.74%顯著高于miR-29c低表達(dá)組患兒54.17%(P<0.05),詳見表4和圖3、圖4。

表4 血清miR-17、miR-29c與患兒生存率的關(guān)系[n(%)]

圖3 ALL患兒5年無事件生存率K-M分析

圖4 ALL患兒5年總生存率K-M分析A.miR-17;B.miR-29c

討 論

AL發(fā)病時骨髓中原始細(xì)胞及幼稚細(xì)胞異常大量增殖，在骨髓中積聚抑制正常造血，并浸潤脾、淋巴結(jié)、肝臟等骨髓外臟器，臨床表現(xiàn)為貧血、浸潤、出血、感染等癥狀[6]。80%以上的AL兒童屬于ALL，近年來，ALL患兒生存率得到很大提高，張鈺等[7]采用CCLG-ALL-2008方案治療ALL患兒，結(jié)果誘導(dǎo)緩解率96.3%，5年總生存率84.72%，5年無事件生存率81.53%。本研究采用CCLG-2008方案治療ALL患兒，誘導(dǎo)緩解率90.70%，5年總生存率72.09%，無事件生存率51.16%，低于張鈺等[7]研究結(jié)果，可能受樣本量、患兒嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)等因素影響。研究表明，多種miRNAs影響造血細(xì)胞發(fā)育、分化，與白血病、淋巴瘤的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)，此外，miRNAs異常表達(dá)可導(dǎo)致抑癌基因或致癌基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控失常，導(dǎo)致白血病發(fā)生[8]。

miR-17由miR-17-92編碼，在血液系統(tǒng)腫瘤、胃癌、肺癌等多種腫瘤中過表達(dá)，發(fā)揮促癌作用。Shi等[9]研究表明，miR-17-92在難治性ALL中過表達(dá)，可能與患者多重抗藥性發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Sharifi等[10]研究表明，抑制miR-17-92可通過調(diào)控p63的表達(dá)，誘導(dǎo)人急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖，提示抑制miR-17-92可作為治療白血病的新靶點。本研究結(jié)果表明，ALL患兒血清中miR-17相對表達(dá)量顯著升高，與患兒初診WBC計數(shù)、免疫分型有關(guān)。兒童ALL預(yù)后相關(guān)因素研究表明，初診WBC計數(shù)≥50×109/L、潑尼松實驗敏感度是導(dǎo)致患兒預(yù)后不良的獨立危險因素[11]。說明血清miR-17表達(dá)水平可能與患兒預(yù)后不良有關(guān)。進(jìn)一步分析死亡患兒和生存患兒血清miR-17表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，死亡患兒血清中miR-17表達(dá)水平顯著高于生存患兒，K-M生存曲線分析顯示，miR-17高表達(dá)患兒5年無事件生存率和總生存率均顯著低于miR-17低表達(dá)患兒，證實miR-17高表達(dá)患兒預(yù)后較差。相關(guān)機(jī)制研究表明，BCR-ABL陽性ALL患者中抗凋亡蛋白BCL2是miR-17的直接靶點，體外實驗證實，BCL2抑制可作為改善BCR-ABL陽性ALL患者治愈性治療或長期疾病控制的新措施[12]。Mian等[13]研究表明，混合譜系白血病(MLL)中miR-17-92簇高表達(dá)，通過抗miR-17-92治療顯著降低MLL融合細(xì)胞系的集落形成能力，并證實PKNOX1是miR-17-92的作用靶點，提示miR-17-92在MEIS1/HOXA961介導(dǎo)的白血病細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用，可被用作新的治療靶點。

miR-29c是miR-29家族成員之一，先前研究表明miR-29c是AML和骨髓分化的調(diào)控因子，在白血病中起腫瘤抑制劑作用。Gong等[14]研究表明，AML外周血單核細(xì)胞中miR-29表達(dá)降低，與信號分子Akt2、CCND2和c-Myc水平增加有關(guān)，動物實驗表明，對AML小鼠注射miR-29c、miR-29a能夠明顯緩解白血病癥狀，提示挽救miR-29家族表達(dá)可能為AML治療提供新策略。但miR-29c在兒童ALL中是否有相同的表達(dá)及意義尚未見報道。本研究結(jié)果，ALL患兒血清miR-29c相對表達(dá)量顯著降低，與初診WBC計數(shù)、免疫分型及潑尼松實驗敏感度有關(guān)，進(jìn)一步分析表明，死亡患兒血清miR-29c表達(dá)水平顯著低于生存患兒，K-M生存曲線分析顯示，miR-29c低表達(dá)患兒5年無事件生存率和總生存率均顯著低于miR-29c高表達(dá)患兒，說明miR-29c在ALL患兒中低表達(dá)與患兒不良預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，miR-17和miR-29c在ALL患兒血清中異常表達(dá)，與患兒初診WBC計數(shù)、免疫分型及潑尼松實驗敏感度等臨床指標(biāo)有關(guān)，可能參與ALL發(fā)生、發(fā)展過程，對患兒預(yù)后產(chǎn)生不良影響。本研究初步說明miR-17和miR-29c可作為ALL患兒的預(yù)后標(biāo)志物，提示miR-17和miR-29c可作為ALL患兒臨床治療的新靶點。今后會繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，探究miR-17和miR-29c在小兒ALL中的調(diào)控機(jī)制。