武雪亮 楊東東 王立坤 何琨

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1普通外科，2超聲醫(yī)學(xué)科，3老干部科（河北張家口075000）

據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，2014年我國居民結(jié)直腸癌發(fā)病例數(shù)位居第三位，嚴(yán)重威脅國民健康［1］。結(jié)直腸癌的早期診斷及規(guī)范治療，對患者生存時間，生存質(zhì)量有著重要影響。從分子生物學(xué)水平，尋找敏感度高、特異性強的標(biāo)記物已成為結(jié)直腸癌早期診斷的研究熱點，同時為腫瘤的放化療、靶向治療提供新的技術(shù)支撐。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是近年來腫瘤發(fā)病機制研究領(lǐng)域的一個新的方向［2］，lncRNA 系無蛋白質(zhì)編碼產(chǎn)物，卻廣泛參與細(xì)胞的生理、病理學(xué)過程，包括細(xì)胞周期、凋亡和信號通路的調(diào)控，其失調(diào)表現(xiàn)在乳腺癌、胃癌、胰腺癌等人類許多諸多惡性腫瘤中［3-5］。HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript anti-sense RNA，HOTAIR）是首個被發(fā)現(xiàn)以反式轉(zhuǎn)錄方式調(diào)控基因表達(dá)的lncRNA［6］，研究證實［7-9］HOTAIR 的沉默與乳腺癌、肺癌、腺癌等人類多個腫瘤的惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切，且抑制腫瘤中HOTAIR 的表達(dá)能有效抑制上述腫瘤細(xì)胞的生長與侵襲能力，因而成為腫瘤致癌機制及靶向研究領(lǐng)域一個新的研究熱點。但目前，HOTAIR 在結(jié)直腸癌方面的研究較少，相關(guān)的作用機制和通路尚不明確。本研究通過檢測HOTAIR 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，分析其與相關(guān)臨床病理因素間的關(guān)系，結(jié)合生存時間的隨訪，以期為結(jié)直腸癌的早期診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測提供準(zhǔn)確、可靠的生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 病例資料本次實驗對象為2012年1月至2014年1月間河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理確診結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本各90 例，同時收集患者完整的臨床資料。

1.2 主要試劑與實驗方法

1.2.1 主要試劑和儀器RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑購自Takara 公司；SYBR Green 實時定量PCR 試劑盒購自美國伯樂公司；HOTAIR 和GAPDH 引物由生工生物（北京）有限公司設(shè)計合成，全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購自瑞士羅氏公司E2010。

1.2.2 RT-PCR法檢測HOTAIR mRNA表達(dá)提取總RNA 并定量，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。lincRNA HOTAIR引物，上游5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；GAPDH 引物，上游5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，下游5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。

PCR 反應(yīng)試劑：SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus），TaKaRa Code：DRR420A 取1 μL 逆 轉(zhuǎn)錄的cDNA 模板，加入10 μL 的2×PrimeSTAR Max Premix，0.4 μL 的sense primer，0.4 μL 的anti-sense primer，加滅菌蒸餾水至20 μL。輕柔混勻，離心。PCR 反應(yīng)體系，95 ℃9 呼育30 s；95 ℃孵育5 s，60 ℃孵育20 s，共反應(yīng)進行40 個循環(huán)；然后72 ℃孵育20 s，95 ℃孵育15 s 終止反應(yīng)。熒光定量PCR實驗數(shù)據(jù)處理使用2-△△Ct法，其中，中位數(shù)以上為高表達(dá)，以下則考慮低表達(dá)。

1.2.3 隨訪通過門診復(fù)查、電話隨訪，時間為2018年10月30日。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0 軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t 檢驗，計數(shù)資料以百分率表示，兩組比較運用χ2檢驗，多組比較應(yīng)用方差分析，用GraphPad Prism 6 軟件繪制統(tǒng)計圖，應(yīng)用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，通過Cox 回歸模型分析結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立影響因素，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測HOTAIR mRNA 的表達(dá)以HOTAIR/GAPDH 比值作為RT-PCR 定量分析，癌組織中HOTAIR mRNA 的表達(dá)水平（0.86 ± 0.05）明顯高于結(jié)直腸正常組織（0.17±0.02），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003，圖1）。

2.2 HOTAIR 表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系HOTAIR 的表達(dá)均與腫瘤的浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移及脈管浸潤有相關(guān)性（均P ＜0.05）。TNM 分期高、分化越低，HOTAIR的表達(dá)水平越高（均P ＜0.05）；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、脈管和神經(jīng)浸潤的患者HOTAIR 的表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)移和非浸潤的患者（均P ＜0.05）；而HOTAIR 的表達(dá)水平與患者腫瘤大小、病理類型、病變部位、腫瘤形態(tài)均無相關(guān)性（均P ＞0.05）。見表1。

2.3 HOTAIR 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存的相關(guān)性隨訪結(jié)果顯示，截止到2018年10月30日，共有48 例患者死亡，生存率為46.66%，其中死亡患者HOTAIR 表達(dá)水平為（0.880 ± 0.105），明顯高于生存患者的（0.662 ± 0.113），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.002）；HOTAIR 高表達(dá)58 例，20 例生存，38例死亡，中位生存時間為23 個月，HOTAIR 低表達(dá)32 例，22 例生存，10 例死亡，中位生存時間為35個月。Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，Log-rank 單變量分析顯示，HOTAIR 高表達(dá)和低表達(dá)患者的生存函數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 7.059，P =0.011），即HOTAIR表達(dá)水平和患者生存時間相關(guān)，HOTAIR陽性患者預(yù)后更差，見圖2。

2.4 Cox 回歸模型分析HOTAIR 表達(dá)水平（95%CI：1.307 ～2.912，P=0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（95%CI：1.041 ～1.620，P ＜0.001）、分化程度（95%CI：1.725～2.363，P = 0.035）等均是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立因素。

圖1 結(jié)直腸癌組織與正常組織lncRNA HOTAIR mRNA 相對表達(dá)量Fig.1 The relative expression of lncRNA HOTAIR mRNA in colorectal cancer tissues and normal tissues

圖2 生存曲線Fig.2 Suvival cure

3 討論

人類HOTAIR 基因位于染色體12q13 區(qū)域，HOXC11 和HOXC12 編碼區(qū)之間，由1 個長外顯子和5 個短外顯子組成。美國斯坦福大學(xué)RINN 等［6］研究證實HOTAIR 主要通過結(jié)合一系列復(fù)雜蛋白復(fù)合體從而調(diào)控下游靶致癌基因和抑癌基因的轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)蛋白的表達(dá)，其中，HOTAIR 5‘結(jié)構(gòu)域結(jié)合RbAp48、EZH2、EED 和SUZ12 共同組成的多梳蛋白抑制復(fù)合物PRC2，反式作用于靶基因H3 組蛋白27 位賴氨酸的三甲基化（H3K27me3），從而抑制下游抑癌相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄；另一方面，HOTAIR 3′結(jié)構(gòu)域主要通過結(jié)合賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（LSD1）/CoREST/REST 復(fù)合物，誘導(dǎo)H3 組蛋白4 位賴氨酸的去基化，從而調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)［10-11］。

表1 結(jié)直腸癌組織中l(wèi)incRNA HOTAIR mRNA 的表達(dá)及與相臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The relation of lincRNA HOTAIR mRNA expression and the clinical pathological parameters in the colorectal tissues ±s

表1 結(jié)直腸癌組織中l(wèi)incRNA HOTAIR mRNA 的表達(dá)及與相臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The relation of lincRNA HOTAIR mRNA expression and the clinical pathological parameters in the colorectal tissues ±s

臨床病例特征病理類型管狀腺癌絨毛狀腺癌乳頭狀癌病變部位直腸左半結(jié)腸右半結(jié)腸分化類型高分化中分化低分化腫瘤大小＜5 cm≥5 cm腫瘤形態(tài)潰瘍型隆起型浸潤型淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)HOTAIR 表達(dá) χ2/F 值1.905 P 值0.371 24 26 40 0.819±0.173 0.802±0.166 0.820±0.170 1.858 0.382 52 17 21 0.811±0.131 0.802±0.157 0.809±0.161 3.235 0.039 30 36 24 0.665±0.142 0.768±0.175 0.849±0.216 0.800 0.427 52 38 0.825±0.163 0.807±0.158 2.507 0.286 38 46 6 0.810±0.154 0.822±0.147 0.815±0.150 5.335＜0.001有 無56 34 0.885±0.122 0.622±0.181 TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期Ⅲ-Ⅳ期肝轉(zhuǎn)移5.179＜0.001 24 66 0.680±0.187 0.876±0.145 6.159＜0.001有 無11 79 0.905±0.113 0.602±0.172脈管浸潤4.975＜0.001有 無26 64 0.881±0.109 0.652±0.116神經(jīng)浸潤6.007＜0.001有無30 60 0.892±0.107 0.605±0.113

GUPTA 等［12］發(fā)現(xiàn)HOTMR 在乳腺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織標(biāo)本中的表達(dá)均升高，轉(zhuǎn)移灶中HOTAIR 的表達(dá)水平高出正常上皮組織含量的200～2 000 倍，因而證實HOTAIR 的表達(dá)水平對乳腺癌的早診和監(jiān)測具有重要意義，同時，高表達(dá)HOTAIR 的腫瘤患者預(yù)后極差。KATAYAMA 等［13］研究證實HOTAIR 在腎細(xì)胞癌的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，其通過調(diào)節(jié)胰島素生長因子結(jié)合蛋白2（IGFBP2）表達(dá)增強腎癌細(xì)胞遷移，HOTAIR 與核分裂，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，和肺轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)；LOEWEN等［14］研究證實HOTAIR 的表達(dá)在肺癌中升高并且與轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)，同時HOTAIR 能促進肺癌細(xì)胞的增殖，存活，侵襲，轉(zhuǎn)移并增強其耐藥性。SVOBODA 等［15］證實結(jié)直腸癌患者血清學(xué)HOTAIR 水平明顯高于健康人群，且血清學(xué)HOTAIR 水平升高是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的不良因素，HOTAIR 血液水平可能成為散發(fā)性結(jié)直腸癌潛在的替代預(yù)后指標(biāo)。但截止目前，仍未有確切研究證實HOTAIR 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)特性及其與癌細(xì)胞增殖、耐藥、浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

本研究從基因水平證實了在結(jié)直腸癌細(xì)胞中HOTAIR mRNA 水平明顯高于正常腸黏膜細(xì)胞，HOTAIR 表達(dá)水平與結(jié)直腸腫瘤的分化程度、浸潤深度、TNM 分期、轉(zhuǎn)移情況均密切相關(guān)，表明HOTAIR 表達(dá)的異常，打破了致癌基因和抑癌基因的平衡，激活了腫瘤細(xì)胞的活性并促進其侵襲增殖，從而加速腫瘤細(xì)胞的擴散和轉(zhuǎn)移。LIN 等［16］應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和Western 印跡法證實HOTAIR 在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤轉(zhuǎn)移，Dukes 分期，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，組織學(xué)類型和分化程度明顯相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。

本研究進一步通過隨訪證實，死亡患者HOTAIR 的表達(dá)水平明顯高于生存患者，且HOTAIR 高表達(dá)患者生存期明顯長于低表達(dá)者，差異明顯，因而HOTAIR 的表達(dá)水平可作為結(jié)直腸癌患者的重要的預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)，同時Cox 回歸模型分析亦證實HOTAIR 表達(dá)水平是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立因素。

綜上，HOTAIR 表達(dá)的異常增高參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和進展過程，深入探究其致癌機制和臨床耐藥性的相關(guān)性有望為結(jié)直腸癌精確診療提供重要的理論依據(jù)，這也將是本課題下一步的研究方向。