董舒婷 彭娟 沙翔垠 姚達(dá)強(qiáng) 戴棐曌 毛雁

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（廣州510260）

翼狀胬肉主要表現(xiàn)為局部球結(jié)膜纖維血管呈三角形增生并侵犯角膜［1］，輕則影響美觀，重則影響視力。主要采用手術(shù)的方式治療［2］，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，目前尚不明確。

瞼裂斑是位于瞼裂區(qū)鼻側(cè)或顳側(cè)的結(jié)膜的良性的病變，呈黃色，輕微隆起［3］，一般無不適，通常不予處理，部分人因影響美觀或反復(fù)出現(xiàn)眼紅、眼癢等炎癥癥狀而手術(shù)切除。與翼狀胬肉相比，瞼裂斑的范圍一般僅局限于結(jié)膜，通常不會(huì)侵犯角膜。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于瞼裂斑發(fā)病機(jī)制的研究較少，有學(xué)者認(rèn)為翼狀胬肉可由瞼裂斑演變而來。

翼狀胬肉與瞼裂斑是與紫外線暴露相關(guān)常見的眼表疾病，均有較高的發(fā)病率，發(fā)病機(jī)制均尚不明確。研究表明，翼狀胬肉中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路異常激活，可能與翼狀胬肉上皮細(xì)胞的增殖相關(guān)，p-ERK 即磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶。含IQ 模序的GTP 酶活化蛋白1（IQGAP1）是一種GTP 酶活化蛋白，參與多種重要的細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間的黏附、細(xì)胞遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究通過比較翼狀胬肉與瞼裂斑組織病理改變的差異，以及p-ERK、IQGAP1在翼狀胬肉和瞼裂斑組織中的表達(dá)差異，探討兩者的發(fā)病機(jī)制的異同。旨在加深對(duì)翼狀胬肉、瞼裂斑兩種常見的眼表疾病的認(rèn)識(shí)，以及探討兩者的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018年1～6月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科行翼狀胬肉切除聯(lián)合結(jié)膜瓣轉(zhuǎn)位加角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)的翼狀胬肉患者及行單純瞼裂斑切除術(shù)的瞼裂斑患者，前者為8 例8 眼的單眼翼狀胬肉標(biāo)本，男2 例，女6例。后者為8 例8 眼的單眼瞼裂斑標(biāo)本，男3 例，女5 例。8 例正常結(jié)膜組織取自眼庫中捐獻(xiàn)者死后24 h 內(nèi)正常眼的非角膜緣結(jié)膜組織?；颊咝g(shù)前均簽署知情同意書，所有試驗(yàn)均遵循赫爾辛基宣言，并通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

1.2 翼狀胬肉及瞼裂斑病理組織觀察將翼狀胬肉組、瞼裂斑組、正常結(jié)膜組3 組織標(biāo)本固定在40%多聚甲醛，常規(guī)脫水、石蠟包埋，作4 μm 連續(xù)切片，進(jìn)行HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察標(biāo)本各層次組織結(jié)構(gòu)，對(duì)翼狀胬肉與瞼裂斑病理表現(xiàn)進(jìn)行比較：（1）先在低倍鏡（× 100）下確定上皮層區(qū)域，然后在高倍鏡（× 400）下隨機(jī)觀察10 個(gè)區(qū)域，計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的上皮層數(shù)，取其平均值作為該例患者上皮層數(shù)量；（2）觀察翼狀胬肉和瞼裂斑上皮細(xì)胞較正常結(jié)膜的形態(tài)改變；（3）血管數(shù)量計(jì)數(shù)：先在低倍鏡（× 100）下觀察整個(gè)標(biāo)本的大體輪廓，確定血管密度較高的區(qū)域，然后在高倍鏡（× 400）下隨機(jī)觀察5 個(gè)視野并計(jì)數(shù)其血管數(shù)量，取其平均值作為該視野的血管數(shù)量。

1.3 免疫組織化學(xué)S-P 法檢測(cè)將手術(shù)切除的組織立即置于磷酸鹽緩沖液（PBS）中，用PBS 沖洗組織3 次，常規(guī)置于4%多聚甲醛中固定。標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，以4 μm 連續(xù)切片后，按試劑說明進(jìn)行S-P 法免疫組化染色。其中抗原修復(fù)采用高壓修復(fù)，二氨聯(lián)苯胺（DAB）顯色5 min，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，光鏡觀察。以PBS 代替一抗孵育，作為陰性對(duì)照，以已知有p-ERK、IQGAP1蛋白表達(dá)的切片做陽性對(duì)照。結(jié)果判定：表達(dá)的強(qiáng)弱均以免疫組化評(píng)分為準(zhǔn)。HIS=結(jié)合陽性細(xì)胞百分比（a）×陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱（b）。每張切片在高倍顯微鏡（× 400）隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野陽性細(xì)胞率，取平均值為該標(biāo)本的陽性細(xì)胞百分比。陽性細(xì)胞百分比（a）分4 個(gè)等級(jí)：無陽性細(xì)胞為0 級(jí)，陽性細(xì)胞占1% ～10%為1 級(jí)，占11%～50%為2 級(jí)，占51%～80%為3 級(jí)，占81%～100%為4 級(jí)。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱（b）分4 個(gè)等級(jí)：陰性為0 級(jí)，弱陽性為1 級(jí)，中度陽性為2 級(jí)，強(qiáng)陽性為3 級(jí)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各項(xiàng)測(cè)量指標(biāo)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每一項(xiàng)指標(biāo)均經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)及正態(tài)性檢驗(yàn)。樣本比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，所有資料的相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色結(jié)果

2.1.1 正常結(jié)膜組織正常結(jié)膜分為上皮層和基質(zhì)層。上皮層近角膜緣處為復(fù)層鱗狀上皮，排列整齊；基質(zhì)層由疏松的結(jié)締組織構(gòu)成，其間有散在的毛細(xì)血管，少量成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞（圖1A）。

2.1.2 翼狀胬肉病理學(xué)改變翼狀胬肉上皮細(xì)胞較正常結(jié)膜明顯增多。體部上皮細(xì)胞呈多邊形，大小均勻；而頭部上皮細(xì)胞明顯增加，上皮的基底細(xì)胞層可見大量核漿比較大的細(xì)胞，排列緊密?；|(zhì)層主要由膠原纖維、成纖維細(xì)胞和大量新生血管構(gòu)成（圖1C）。

2.1.3 瞼裂斑病理學(xué)改變瞼裂斑分為上皮層和基質(zhì)層。瞼裂斑上皮細(xì)胞與結(jié)膜相比無明顯增多，基質(zhì)層主要為無定型、嗜伊紅染色的玻璃樣變性或顆粒樣變性的膠原物質(zhì)，其間點(diǎn)綴著斷裂、卷曲或碎片狀的彈力樣纖維（圖1B）。

圖1 正常結(jié)膜、瞼裂斑、翼狀胬肉的病理切片（HE×600）Fig.1 Pathological section of normal conjunctiva，pinguecula and pterygium（HE×600）

2.1.4 翼狀胬肉與瞼裂斑的比較（1）上皮層數(shù)比較：翼狀胬肉上皮層數(shù)較瞼裂斑及結(jié)膜上皮層數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）血管數(shù)量的比較：翼狀胬肉血管數(shù)量明顯多于瞼裂斑及結(jié)膜血管數(shù)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。瞼裂斑血管數(shù)量較結(jié)膜血管數(shù)量輕度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

2.2.1 p-ERK 的表達(dá)情況p-ERK 光鏡下主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)于細(xì)胞核中，陽性染色棕黃色或褐色顆粒。p-ERK 在翼狀胬肉、瞼裂斑、結(jié)膜組織中均表達(dá)，主要表達(dá)在上皮層，基底細(xì)胞層表達(dá)最強(qiáng)，其中在翼狀胬肉中表達(dá)最強(qiáng)，瞼裂斑次之，結(jié)膜最弱。翼狀胬肉、瞼裂斑組織中p-ERK 表達(dá)水平明顯高于正常結(jié)膜（表2、圖2）。

2.2.2 IQGAP1 的表達(dá)情況IQGAP1 在翼狀胬肉及瞼裂斑中表達(dá)，主要在上皮層表達(dá)，其中基底細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)。IQGAP1 在結(jié)膜組織中未見陽性表達(dá)。IQGAP1 光鏡下主要表達(dá)于細(xì)胞膜和胞漿著色，陽性染色為棕黃色或褐色顆粒。翼狀胬肉、瞼裂斑組織中IQGAP1 表達(dá)水平明顯高于正常結(jié)膜（表2、圖3）。

表1 翼狀胬肉、瞼裂斑、結(jié)膜中上皮層數(shù)及血管數(shù)量Tab.1 The amount of epithelial layer and blood vessels in pterygium，pinguecula and conjunctiva ±s

表1 翼狀胬肉、瞼裂斑、結(jié)膜中上皮層數(shù)及血管數(shù)量Tab.1 The amount of epithelial layer and blood vessels in pterygium，pinguecula and conjunctiva ±s

分組結(jié)膜瞼裂斑翼狀胬肉F 值P 值上皮層數(shù)4.4±0.699 5.4±1.504c 10±4.137b 13.47＜0.05血管數(shù)量5.4±0.894 6.8±0.837c 12.2±1.483b 52.27＜0.05

表2 結(jié)膜、瞼裂斑、翼狀胬肉中p-ERK 及IQGAP1 的表達(dá)量Tab.2 The expression of P-ERK and IQGAP1 in conjunctiva，pinguecula and pterygium ±s

表2 結(jié)膜、瞼裂斑、翼狀胬肉中p-ERK 及IQGAP1 的表達(dá)量Tab.2 The expression of P-ERK and IQGAP1 in conjunctiva，pinguecula and pterygium ±s

注：a，瞼裂斑與結(jié)膜相比，P ＜0.05；b，翼狀胬肉與結(jié)膜相比，P ＜0.05；C，瞼裂斑與翼狀胬肉相比，P ＜0.05

分組結(jié)膜瞼裂斑翼狀胬肉F 值P 值p-ERK 免疫組化評(píng)分1.8±0.447 9.6±0.548a 10.8±1.643b 111.938＜0.05 IQGAP1 免疫組化評(píng)分1.0±0.000 5.0±0.000ac 10.2±1.789b 99.75＜0.05

圖2 正常結(jié)膜、瞼裂斑、翼狀胬肉中p-ERK 的表達(dá)（SP×600）Fig.2 The expression of p-ERK in normal conjunctiva，pinguecula，and pterygium（SP×600）

圖3 正常結(jié)膜、瞼裂斑、翼狀胬肉組織中IQGAP1 的表達(dá)（SP×600）Fig.3 The expression of IQGAP1 in normal conjunctiva，pinguecula and pterygium（SP×600）

2.2.3 相關(guān)性分析在翼狀胬肉中，p-ERK 與IQGAP1 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.982，P＜0.05）。

3 討論

翼狀胬肉與瞼裂斑均為常見眼表疾病。兩者的發(fā)病機(jī)制尚不明確。兩者均為球結(jié)膜上的病變，兩者在病理組織結(jié)構(gòu)存在相似之處。具體兩者發(fā)病機(jī)制差別的相關(guān)研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，翼狀胬肉及瞼裂斑上皮的基底細(xì)胞，均為形態(tài)規(guī)則，核漿比大的細(xì)胞，顯示是增殖活躍的細(xì)胞。與正常結(jié)膜相比，翼狀胬肉上皮層數(shù)與瞼裂斑上皮層數(shù)增加。翼狀胬肉與瞼裂斑相比，上皮層數(shù)明顯增加。說明翼狀胬肉上皮細(xì)胞的增殖較瞼裂斑活躍，瞼裂斑上皮細(xì)胞也存在增殖潛能。既往的研究顯示翼狀胬肉與瞼裂斑上皮均存在增殖潛能，翼狀胬肉上皮增殖能力較強(qiáng)［3-4］。與本研究的結(jié)果一致。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，翼狀胬肉基質(zhì)層中血管數(shù)量也較瞼裂斑基質(zhì)層的血管數(shù)量明顯增加。翼狀胬肉上皮的增殖較瞼裂斑活躍，基質(zhì)層血管數(shù)量明顯增多，是翼狀胬肉通常侵犯角膜，而瞼裂斑通常原位生長(zhǎng)的病理學(xué)基礎(chǔ)。兩者的基質(zhì)深層均可見大片的膠原變性。翼狀胬肉與瞼裂斑病理結(jié)構(gòu)有一定的相似性，提示兩者存在部分相同的發(fā)病機(jī)制。

ERK 是MAPK 家族成員之一，屬于絲氨酸/蘇氨殘基的蛋白激酶，是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要途徑。ERK 磷酸化后即p-ERK，進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂及細(xì)胞間的功能同步等多種生理過程［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，與結(jié)膜相比，p-ERK 在翼狀胬肉中表達(dá)增加。研究顯示，翼狀胬肉中增殖標(biāo)志物如Ki-67、PCNA、cyclin D1等表達(dá)上調(diào)［6］。ERK信號(hào)通路與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，在多種細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞增殖活動(dòng)［7-9］。翼狀胬肉上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮中p-ERK 表達(dá)，提示上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中ERK 信號(hào)通路激活，可能跟上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活動(dòng)增加相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，與結(jié)膜相比，p-ERK 在瞼裂斑中表達(dá)增加。研究顯示，瞼裂斑上皮具有增殖潛能［3］。筆者推測(cè)，與翼狀胬肉相似，ERK 信號(hào)通路同樣參與瞼裂斑上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖?？赡苡捎趦烧呔鶠槁∑鹩谘郾淼募膊?，上皮細(xì)胞暴露在空氣中，從而引起兩者的上皮鱗狀化生。提示兩者發(fā)病機(jī)制存在一定的相似性。有可能是疾病發(fā)展不同階段，或者是某個(gè)通路的激活的導(dǎo)致疾病的轉(zhuǎn)化。

IQGAP1 是一種GTP 酶活化蛋白，調(diào)節(jié)多種重要的細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間的黏附、細(xì)胞遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)細(xì)胞的正常發(fā)育和疾病過程都產(chǎn)生重要影響［10-11］。還參與細(xì)胞的增殖和侵襲的調(diào)控［12-13］。本研究首次發(fā)現(xiàn)，IQGAP1 在結(jié)膜幾乎未見陽性表達(dá)，而在翼狀胬肉頭部上皮全層均呈陽性表達(dá)，在基底細(xì)胞及鄰近基底細(xì)胞的上層細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)；在翼狀胬肉體部，IQGAP1 主要表達(dá)在基底細(xì)胞中。既往的研究表明，IQGAP1參與細(xì)胞的增殖的調(diào)控，筆者推測(cè)IQGAP1 對(duì)翼狀胬肉細(xì)胞增殖有一定的作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，在瞼裂斑組織中也可見陽性表達(dá)，與翼狀胬肉體部的表達(dá)相似。筆者進(jìn)一步對(duì)翼狀胬肉與瞼裂斑的IQGAP1 的表達(dá)量行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯示翼狀胬肉的IQGAP1 表達(dá)量較瞼裂斑增加。基底細(xì)胞層含有較多的干細(xì)胞，高增殖潛能是干細(xì)胞的特點(diǎn)之一，在損傷等條件下較其他細(xì)胞具有更高的增殖潛能。筆者推測(cè)在紫外線等致病因素?fù)p傷角膜緣基底細(xì)胞，激活基底細(xì)胞的IQGAP1，使角膜緣基底細(xì)胞較其他細(xì)胞有更高增殖潛能，從而導(dǎo)致翼狀胬肉與瞼裂斑的發(fā)生。

本研究顯示，翼狀胬肉中p-ERK 與IQGAP1 的表達(dá)量具有正相關(guān)性。多項(xiàng)研究表明，ERK 信號(hào)通路的激活依賴IQGAP1 的活化［14-17］。筆者推測(cè)，IQGAP1 在紫外線等致病因素的作用下活化，激活了ERK 信號(hào)通路，使細(xì)胞異常分化與增殖。而這一作用主要體現(xiàn)在翼狀胬肉上皮細(xì)胞的基底細(xì)胞中。同時(shí)也可能在瞼裂斑的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，在翼狀胬肉及瞼裂斑中，ERK 信號(hào)通路激活可能依賴IQGAP1 的活化參與兩者的發(fā)病過程，提示兩者發(fā)病機(jī)制有一定的相似之處。由于樣本量不足，筆者計(jì)劃在增加樣本量的前提下，對(duì)翼狀胬肉及瞼裂斑中p-ERK、IQGAP1 表達(dá)進(jìn)一步作定量研究。以期找到新的治療翼狀胬肉和瞼裂斑的靶點(diǎn)。