曹云剛， 陳星怡， 齊夢恬， 李 穎， 趙倩倩

(陜西科技大學 食品與生物工程學院, 陜西 西安 710021)

0 引言

茶多酚(Tea Polyphenols)是茶葉中多酚類物質的總稱，是目前應用最廣泛的天然抗氧化劑之一，其主要活性成分是兒茶素類化合物(Catechin)，約占茶多酚含量的75%～80%.兒茶素類化合物主要分為四種：表兒茶酚(epicatechin EC)、表沒食子兒茶酚(epigallocatechin EGC)、表兒茶酚沒食子酸(epicatechin gallate ECG)和表沒食子兒茶酚沒食子酸(epigallocatechin gallate EGCG)[1-3].

其中EGCG是 2-連苯酚基苯并吡喃與沒食子酸形成的酯，結構中含有6個鄰位酚羥基(如圖1所示)，是兒茶素中含量最高、抗氧化能力最強的組分.同時現(xiàn)有研究表明EGCG還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗突變、降壓、降脂、降血糖、防止消化道和呼吸道感染、預防和治療癌癥、抑制和預防心血管疾病等生理活性功能[4,5].因此，EGCG和其他兒茶素類化合物經常被用做功能性食品(如乳品和飲料等)的添加劑.

然而，研究發(fā)現(xiàn)兒茶素類物質在中性和堿性條件下非常不穩(wěn)定，隨著pH、溫度和氧氣濃度的升高，降解速度逐漸加快[6].EGCG 的氧化物和聚合物會產生一種不期望的黃綠色，諸如此類的不穩(wěn)定性限制了EGCG在食品工業(yè)中的應用[7].如何提高EGCG在加熱等過程中的穩(wěn)定性是當前面臨的挑戰(zhàn).

圖1 EGCG結構示意圖

酪蛋白是牛乳中含量最高的蛋白質，約占牛乳中總蛋白的80%左右，具有較高的營養(yǎng)價值和良好的加工性能.牛乳酪蛋白包含四種主要蛋白質：αs1-酪蛋白,αs2-酪蛋白,β-酪蛋白和κ-酪蛋白，這四種蛋白的摩爾比約為4∶1∶4∶1.3，在酪蛋白中的含量分別為：αs1-酪蛋白≥22%、αs2-酪蛋白≥5.5%、β-酪蛋白≥22%、κ-酪蛋白≥7.15%[7-9].這四種酪蛋白分子量接近(均約為24 kDa)，并含有很大比例的脯氨酸殘基.其中β-酪蛋白由209個氨基酸組成且不含二硫鍵，其相對靈活(松散、自然展開)的結構使得其對熱更加穩(wěn)定，且易于與其他物質結合[9].現(xiàn)有研究已經表明，β-酪蛋白可以與疏水性和雙親化合物如維生素D、槲皮素、白藜蘆醇、黃酮、姜黃素和丹寧酸等相互作用，從而作為它們的天然納米運載工具[7].蛋白質與多酚類物質相互作用受蛋白質和多酚結構、溫度、pH等因素的影響，二者結合又會影響各自的功能特性及生物利用率.

因此，本研究采用熒光猝滅法探究不同溫度下β-酪蛋白與EGCG的相互作用機制，以期為合理控制食品加工條件改善EGCG的穩(wěn)定性、科學設計天然活性組分的蛋白納米載體等提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

(1)主要材料與試劑：β-酪蛋白(≥98%)，Sigma-Aldrich公司；EGCG(>98%)，上海純優(yōu)生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸，天津市天力化學試劑有限公司；純凈水，娃哈哈集團.

(2)主要儀器設備：PHS-25型數(shù)顯pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司；微量移液器，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋,天津市泰斯特儀器有限公司； FS5熒光光譜儀,英國愛丁堡儀器公司；MIX-25P型迷你混合儀，杭州米歐儀器有限公司；TP-350S型智能磁力加熱攪拌器，杭州米歐儀器有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品溶液的配置

β-酪蛋白存儲液(10.0μmol/L)：用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH6.5)配制濃度為10.0μmol/Lβ-酪蛋白溶液，置于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?

EGCG工作液(100.0μmol/L)：用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH6.5)配制濃度為100.0μmol/L EGCG溶液.用PBS溶液稀釋出一系列濃度梯度的EGCG溶液：0、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L和100μmol/L.所有EGCG溶液現(xiàn)配現(xiàn)用.

1.2.2 熒光猝滅分析

將不同濃度EGCG 溶液(0、1、2、4、10、20、40、60、80和100μmol/L)與β-酪蛋白溶液(10.0μmol/L)按照1∶1比例混合均勻(各2.5 mL)，在不同溫度(25 ℃、35 ℃和45 ℃)水浴中加熱30 min后，迅速冷卻至室溫.最終混合液中，β-酪蛋白終濃度為：5.0μmol/L，EGCG終濃度梯度為：0、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L.同時將不同濃度EGCG 溶液(0、1、2、4、10、20、40、60、80和100μmol/L)與20 mmol/L磷酸鹽緩沖液按照1∶1比例混合均勻(各2.5 mL)作為空白對照.參考范志飛等人描述的方法[10]，在室溫下利用熒光光譜儀記錄混合液體和相應空白對照的熒光強度，設定激發(fā)波長為 280 nm，掃描波長為 300～500 nm，激發(fā)狹縫寬度為3.3 nm，發(fā)射狹縫寬度為2.0 nm.

2 結果與討論

2.1 不同加熱處理對β-酪蛋白內源熒光的影響

β-酪蛋白含有一個位于蛋白表面的色氨酸殘基(Trp143)，Trp143受激發(fā)后發(fā)射的熒光是β-酪蛋白內源熒光的主要來源[11].蛋白質最大內源熒光強度(Fmax)和對應的最大熒光發(fā)射波長(λmax)的變化可以間接反映蛋白構象的變化[12].

如表1所示，無EGCG存在時，不同溫度處理對β-酪蛋白的Fmax和λmax具有不同的影響：與對照(25 ℃)相比，35 ℃處理幾乎無影響；45 ℃處理30 min導致β-酪蛋白的Fmax升高約3.0%，同時λmax紅移動約2 nm；這說明45 ℃處理30 min對β-酪蛋白中的Trp143殘基的微環(huán)境產生了較為明顯的影響，或者說該條件下處理使得β-酪蛋白中的Trp143殘基的微環(huán)境變得更加親水性或極性[7].加熱溫度對β-酪蛋白內源熒光的影響與其自身的結構變化以及β-酪蛋白自我締合與解離行為有關：在低溫(0～8 ℃)下，β-酪蛋白以單體的形式存在于溶液中；當溫度高于20 ℃時，β-酪蛋白單體發(fā)生聚合和自我締合；當溫度高于90 ℃時，β-酪蛋白聚集體發(fā)生熱解離[13].

表1 不同溫度處理后β-酪蛋白的最大內源熒光強度(Fmax)和對應最大熒光發(fā)射波長(λmax)

2.2 β-酪蛋白-EGCG復合物的熒光猝滅

不同溫度(25 ℃、35 ℃和45 ℃)下，β-酪蛋白與EGCG相互作用的熒光淬滅光譜如圖2所示.從圖2可以看出，隨著 EGCG 濃度的增加，β-酪蛋白的熒光發(fā)射峰強度逐漸降低，當EGCG終濃度為 50μmol/L時，β-酪蛋白的熒光發(fā)射峰強度最低，由此可以推斷EGCG 與β-酪蛋白生成了復合物，同時也改變了β-酪蛋白的空間結構[14]：與EGCG的結合導致β-酪蛋白的分子構象進一步展開，使得色氨酸殘基(Trp143)暴露于更加親水的環(huán)境中.不同溫度下，EGCG對β-酪蛋白的熒光猝滅程度不同，比如，當EGCG終濃度為 50μmol/L時，熒光猝滅率分別為77.8%(25 ℃)、76.5%(35 ℃)和84.6%(45 ℃)，說明溫度升高增強了EGCG與β-酪蛋白之間的相互作用.與本實驗結果類似，He等[7]研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高EGCG對β-酪蛋白的熒光猝滅作用增強.

(a)25 ℃下EGCG對β-酪蛋白的熒光猝滅光譜

(b)35 ℃下EGCG對β-酪蛋白的熒光猝滅光譜

(c)45 ℃下EGCG對β-酪蛋白的熒光猝滅光譜圖2 EGCG對β-酪蛋白的熒光猝滅光譜

熒光猝滅反應的類型主要有：動態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅[15].無論EGCG對β-酪蛋白的熒光猝滅是一個動態(tài)猝滅或者靜態(tài)猝滅過程，均可根據Stern-Volmer 方程(1)計算其雙分子熒光猝滅速率常數(shù)(Kq)，據此可判定其猝滅類型.

F0/F=1+Kqτ0c(EGCG)=1+

KSVc(EGCG)

(1)

式(1)中：F0和F分別為EGCG加入前后β-酪蛋白熒光發(fā)射峰的強度；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)(L/(mol·s))；τ0為不存在熒光猝滅劑時的熒光壽命(對于生物大分子來說τ0=10-8s-1)[16]；c(EGCG)是熒光猝滅劑EGCG的濃度(mol/L).KSV是Sterne-Volmer 動態(tài)猝滅常數(shù)(L/mol)，可以通過F0/F對c(EGCG)做線性回歸，其線性部分的斜率即為KSV.

根據方程式(1)，對于單一的動態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅過程,以β-酪蛋白與EGCG作用前后熒光發(fā)射峰的強度變化F0/F對熒光猝滅劑濃度c(EGCG)為軸制作散點圖并算出趨勢線方程，方程的斜率代表Sterne-Volmer 動態(tài)猝滅常數(shù)KSV.

圖3為不同溫度(25 ℃、35 ℃和45 ℃)下β-酪蛋白與不同濃度EGCG相互作用的熒光發(fā)射峰的強度F0/F-c(EGCG) 曲線.從圖3可以看出，F(xiàn)0/F-c(EGCG)呈線性關系，隨著溫度升高熒光猝滅曲線的斜率增加，并且可以計算出25 ℃、35 ℃ 和45 ℃ 下雙分子猝滅速率常數(shù)Kq分別為0.664×1013L/(mol·s)、0.629×1013L/(mol·s)和0.945×1013L/(mol·s).

一般情況下，生物大分子的雙分子熒光動態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq小于2×1010L/(mol·s)，由此可以判斷 EGCG對β-酪蛋白的熒光猝滅是由于 EGCG 與β-酪蛋白形成了復合物而引起的靜態(tài)猝滅，是通過熒光基團(Trp143)與熒光猝滅劑(EGCG)之間形成了一個復雜的循環(huán)[17,18].不同溫度下EGCG對β-酪蛋白的雙分子猝滅速率常數(shù)Kq的變化與溫度誘導的β-酪蛋白構象變化等有關.

圖3 不同溫度下EGCG對β-酪蛋白熒光猝滅的Stern-Volmer曲線

2.3 EGCG與β-酪蛋白的表觀結合常數(shù)及結合位點數(shù)

由于EGCG對β-酪蛋白的熒光猝滅主要是靜態(tài)猝滅，其結合常數(shù)(KA)和結合位點數(shù)(n)可通過公式(2)計算得出：

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlgc(EGCG)

(2)

式(2)中：F0和F分別為EGCG加入前后β-酪蛋白熒光發(fā)射峰的強度；KA為結合常數(shù)；n為結合位點數(shù)；c(EGCG)為EGCG濃度(mol/L).

以lg[(F0-F)/F]對lgc(EGCG)作圖，本實驗范圍內呈線性關系，因而擬合直線的斜率為結合位點數(shù)(n)，截距為結合常數(shù)(KA)，計算結果見表2.

由計算結果可知，EGCG與β-酪蛋白的結合常數(shù)達104數(shù)量級，并形成一個結合位點.在25 ℃溫度條件下二者之間就能較好的結合，溫度升高有利于二者之間的結合.朱美霖等[14]在研究EGCG與人血清白蛋白(HSA)相互作用時也得到了類似的實驗結果.

表2 不同溫度下EGCG 與β-酪蛋白的結合常數(shù)(KA)和結合位點數(shù)(n)

2.4 EGCG 與 β-酪蛋白的主要作用力類型

生物大分子與小分子的作用力類型一般包括：氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力這四種[19].根據不同溫度下的熱力學參數(shù)：焓變ΔH、自由能變化ΔG和熵變ΔS等，可以判斷EGCG與β-酪蛋白的主要作用力類型.

在溫度變化范圍不大時，ΔH 可看作是常數(shù)，由熱力學參數(shù)方程(3，4)可以計算出EGCG和β-酪蛋白在不同溫度下相互作用的熱力學參數(shù)值,結果見表3所示.

ln(K2/K1)=(1/t1-1/t2)ΔH/R

(3)

ΔG=ΔH-tΔS=-RtlnK

(4)

式(3)、(4)中：K1，K2分別為不同溫度下EGCG與β-酪蛋白的結合常數(shù)(KA)；t1，t2分別為不同溫度，單位為K；R為氣體常數(shù)，R=8.314J/(mol·K)；ΔH為焓變；ΔG為自由能變化；ΔS為熵變.

表3 不同溫度下EGCG與β-酪蛋白結合過程的熱力學參數(shù)

ΔG為吉布斯自由能，是在某一個熱力學過程中，系統(tǒng)減少的內能中可以轉化為對外做功的部分.當ΔG<0時反應自發(fā)；ΔG>0時反應逆方向自發(fā)；ΔG=0時反應平衡[20].從表3可以看出,EGCG與β-酪蛋白的復合物在形成過程中的ΔG<0，說明結合過程是一個自發(fā)過程.生物大分子與小分子作用力類型的熱力學規(guī)律為：(1)ΔS>0的情況下作用力類型可能是疏水作用力與靜電作用力；(2)ΔH>0同時ΔS>0的情況下作用力類型為疏水作用力；(3)ΔH<0的情況下作用力類型主要為靜電相互作用[19].根據此規(guī)律并結合上述結果分析可知，該體系中EGCG與β-酪蛋白之間的作用力是以疏水作用力為主.由于ΔH

3 結論

采用熒光猝滅法研究了不同溫度下β-酪蛋白與EGCG之間的相互作用，研究結果表明： EGCG與β-酪蛋白發(fā)生了靜態(tài)熒光猝滅，形成了β-酪蛋白-EGCG復合物；當溫度為25 ℃、35 ℃和45 ℃時，其雙分子猝滅速率常數(shù)Kq分別為0.664×1013L/(mol·s)、0.629×1013L/(mol·s) 和0.945×1013L/(mol·s)，結合位點數(shù)分別為0.836 6、0.922 3與0.958 6.熱力學參數(shù)分析結果顯示EGCG 與β-酪蛋白形成復合物的過程中ΔG<0，說明該結合過程是一個自發(fā)過程，ΔH>0且ΔS>0說明EGCG與β-酪蛋白之間的作用力是以疏水相互作用為主.