潘爭艷 邱福林 呂桂蘭 馬秀芳 商文奇 白元俊,* 徐正進(jìn)

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遼寧省粳稻品種稻瘟病抗性基因分析

潘爭艷1,2邱福林1呂桂蘭1馬秀芳1商文奇1白元俊1,*徐正進(jìn)2,*

(1遼寧省水稻研究所, 沈陽 110101;2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 沈陽 110866;*通訊聯(lián)系人, E-mail: cycbyj@126.com; xuzhengjin@126.com)

【目的】為明確遼寧省260份粳稻品種中稻瘟病抗性基因的類型，評(píng)價(jià)抗性基因利用價(jià)值，為遼寧省水稻抗病育種提供參考?！痉椒ā窟x用9個(gè)稻瘟病抗性基因的特異引物分析遼寧省已審定的260份粳稻品種抗性基因種類、基因組合類型及地域分布情況，基于抗病基因檢測(cè)條帶的有無進(jìn)行品種聚類分析，苗期人工噴霧接種、分蘗盛期和蠟熟期田間自然發(fā)病調(diào)查，評(píng)價(jià)9個(gè)抗性單基因系的抗病性?！窘Y(jié)果】遼寧省粳稻品種中含有抗性基因數(shù)量從0~7個(gè)不等，抗性基因檢出率最高，其次是和；所有參試品種均未檢測(cè)到基因，僅在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的遼粳421中檢測(cè)到基因。參試的水稻品種中共有62個(gè)基因組合類型。基于抗性基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，可以將260份粳稻材料分為11個(gè)類群。9個(gè)抗性單基因系中，抗性最好；其次是和?！窘Y(jié)論】抗性基因、和在遼寧省粳稻品種選育和生產(chǎn)上具有重要的應(yīng)用潛力；參試品種的80.38%集中在第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ類群，沒有明顯的地域差異；參試品種抗病基因組合類型不夠豐富，親緣關(guān)系較近。

粳稻；稻瘟病；抗性基因

遼寧省水稻品種經(jīng)歷了7~8次的更新，每一次品種的更新水稻產(chǎn)量隨之提高10%左右，為遼寧省的糧食生產(chǎn)提供了保障[1]。但目前遼寧粳稻品種存在一些問題，審定的品種和骨干親本親緣關(guān)系較近、遺傳基礎(chǔ)相對(duì)單一[2-3]；抗病品種抗譜較窄、抗病基因型不明確[4-5]等。如何選擇骨干親本、延長選育品種的使用壽命、提高品質(zhì)、增強(qiáng)品種抗性是目前遼寧省水稻品種選育中亟待解決的問題。

稻瘟病是阻礙水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要因素之一，從20世紀(jì)90年代開始，全國稻瘟病發(fā)病面積年均超過4 千萬hm2，造成的損失高達(dá)10 億kg[6]?？共∑贩N選育是防治稻瘟病有效方法之一，稻瘟病抗性基因的多少又決定了親本在育種中的應(yīng)用范圍。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，全世界已鑒定了100多個(gè)稻瘟病主效基因及QTL位點(diǎn)，在水稻第6染色體位點(diǎn)至少有10個(gè)不同的等位抗性基因，其中、和基因有較好的利用價(jià)值而被廣泛利用[7-10]。

本研究選擇了、、、、、、、和共9個(gè)抗性基因特異引物對(duì)260份已審定的遼寧省粳稻品種進(jìn)行稻瘟病抗性基因檢測(cè)，分析抗性單基因系的苗期、分蘗盛期和蠟熟期的抗病性，并對(duì)抗性基因利用價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

遼寧省各地區(qū)育成審定的品種260份（由遼寧省水稻研究所保存繁育）。2017年4月20日播種，5月25日移栽，常規(guī)管理。分蘗盛期采集葉片，進(jìn)行抗性基因分析。9個(gè)抗性單基因系由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

表1 引物信息

1.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增

利用CTAB法提取總DNA，以總DNA為模板，引物信息見表1。

PCR體系如下：DNA模板2 μL，正反引物各2 μL，酶10 μL，加ddH2O至總體積20 μL。PCR程序如下：95℃下預(yù)變性5 min；95℃下變性30 s，退火，72℃下延伸，35個(gè)循環(huán)；72℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物在含有溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠電泳1.5 h，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

1.3 單基因系抗性鑒定

1.3.1 稻瘟病菌來源

苗期人工噴霧接種單個(gè)菌株，38株具有強(qiáng)致病性的菌株分離自遼寧省4個(gè)生態(tài)稻區(qū)，其中遼寧中部平原稻區(qū)9株（沈陽市，遼寧省水稻研究所）、遼河平原三角洲鹽堿稻區(qū)4株（遼寧省盤錦市大洼縣東風(fēng)鎮(zhèn)東風(fēng)農(nóng)場(chǎng)）、遼北平原中早熟稻區(qū)6株（遼寧省鐵嶺市農(nóng)業(yè)科學(xué)院）和遼寧東南沿海晚熟稻區(qū)19株（東港市示范農(nóng)場(chǎng)），所有菌株均為遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.3.2 稻瘟病菌活化、繁殖及產(chǎn)孢

菌株產(chǎn)孢方法參考汪文娟[21]和褚晉[22]等方法，菌株的活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，產(chǎn)孢培養(yǎng)基為玉米粒培養(yǎng)基。菌株塊接種到玉米粒培養(yǎng)基至玉米粒表面長出大量氣生菌絲，用無菌水洗去氣生菌絲并進(jìn)行保濕處理，待產(chǎn)生足夠多的分生孢子后，無菌水洗下孢子，配制成濃度為1.5×105個(gè)/mL接種用孢子懸浮液。

1.3.3 抗性單基因系苗期抗性評(píng)價(jià)

單基因系水稻種子經(jīng)浸種、催芽后每9個(gè)品種播種于一個(gè)塑料育苗盤內(nèi)（育苗土為滅菌后的育苗基質(zhì)），每育苗盤內(nèi)設(shè)麗江新團(tuán)黑谷為感病對(duì)照。待稻苗長到4~5葉期時(shí)進(jìn)行噴霧接種。每育苗盤噴霧50 mL孢子懸浮液。接種后，將育苗盤放置于25℃接種室內(nèi)保濕24 h，然后移至溫室，25℃~28℃下保濕培育。接種7 d后，感病對(duì)照充分發(fā)病，調(diào)查所有材料的發(fā)病情況。

1.3.4 抗性單基因系田間抗性評(píng)價(jià)

分別在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、盤錦市大洼縣東風(fēng)鎮(zhèn)東風(fēng)農(nóng)場(chǎng)、鐵嶺市農(nóng)業(yè)科學(xué)院和東港市示范農(nóng)場(chǎng)設(shè)立田間自然誘發(fā)抗病鑒定圃，均以麗江新團(tuán)黑谷為感病對(duì)照。于分蘗盛期和蠟熟期調(diào)查記載葉瘟和穗瘟發(fā)生情況。

1.3.5 抗性單基因系利用價(jià)值評(píng)價(jià)

抗性單基因系的利用價(jià)值評(píng)價(jià)采用抗性頻率、發(fā)病率及抗性綜合指數(shù)法[23]。

抗性頻率(%)=(接種后表現(xiàn)抗的菌株數(shù)/接種總菌株數(shù))×100；穗瘟或葉瘟發(fā)病率(%)=(發(fā)病穗或葉數(shù)/調(diào)查總穗或葉數(shù))×100；綜合指數(shù)=葉瘟病級(jí)×0.25+穗瘟病級(jí)×0.25+穗瘟損失率×0.5。

M?DL2000。A?YL155/YL87Pita；B?YL183/YL87Npita；C?Pikh；D?Pi40。泳道1~15分別為遼星1號(hào)~遼星8號(hào)、遼星10~遼星16；從上到下對(duì)照分別為Pita、Pita、Pikh和Pi40單基因系。

Fig. 1. Detection results of,andof some rice varieties in Liaoning.

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 20.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 遼寧省粳稻品種攜帶抗性基因類型及地域分布情況

利用12對(duì)稻瘟病特異引物檢測(cè)了遼寧省260個(gè)粳稻品種中攜帶的抗性基因類型，未檢測(cè)到基因，其余8個(gè)抗性基因在遼寧省粳稻品種中均有分布。抗性基因檢出率最高，為84.23%，其次是和。在基因簇的4個(gè)基因中，抗性基因的檢出率最高，為37.69%，其次是，檢出率為0.38%，僅在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的遼粳421中檢測(cè)到(表2和圖1)。

遼寧省各地域粳稻品種抗病基因種類和優(yōu)勢(shì)基因也存在差異。在遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的粳稻品種中，8個(gè)稻瘟病抗性基因、、、、、、和均有分布，優(yōu)勢(shì)抗性基因?yàn)?。盤錦地區(qū)及鹽堿地研究所、沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)、丹東地區(qū)、撫順地區(qū)、東亞種業(yè)和營口地區(qū)育成的粳稻品種含有除外的其余7個(gè)稻瘟病抗性基因。盤錦地區(qū)及鹽堿地研究所選育的品種中的優(yōu)勢(shì)抗性基因?yàn)楹?；沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)、東亞種業(yè)和營口地區(qū)選育的品種中的優(yōu)勢(shì)抗性基因?yàn)楹?；丹東地區(qū)和撫順地區(qū)優(yōu)勢(shì)抗性基因?yàn)椤⒑?。鐵嶺地區(qū)和開原地區(qū)育成的品種含有除和之外的其余6個(gè)抗性基因，鐵嶺地區(qū)優(yōu)勢(shì)抗性基因?yàn)椤⒑?；開原地區(qū)優(yōu)勢(shì)抗性基因?yàn)?。莊河地區(qū)育成的品種共含有5個(gè)抗性基因，優(yōu)勢(shì)抗性基因?yàn)?、和?/p>

2.2 遼寧省粳稻品種含有抗性基因數(shù)量及基因組合類型分析

260份水稻品種含有的基因數(shù)量從0~7個(gè)不等（表3）。鹽粳933和富友33含有除和之外的7個(gè)抗性基因。遼粳390等10個(gè)品種含有6個(gè)抗性基因和6個(gè)基因類型，分別是遼粳390不含；丹旱稻4號(hào)不含；美鋒9號(hào)、福粳8號(hào)、民喜9號(hào)、富粳357和橋科951不含；晨宏36不含；遼粳212不含；鹽粳377不含。港稻1號(hào)等16個(gè)品種含有5個(gè)抗性基因和10個(gè)基因組合類型。豐民2102等46個(gè)品種含有4個(gè)抗性基因和13個(gè)基因組合類型。中丹4號(hào)等90個(gè)品種含有3個(gè)抗性基因和17個(gè)基因組合類型。鹽粳68等72個(gè)品種含有2個(gè)抗性基因和10個(gè)基因組合類型。沈農(nóng)265等20個(gè)品種含有1個(gè)抗性基因和4個(gè)基因組合類型，其中，豐民2102、丹粳10號(hào)、遼鹽282、沈農(nóng)611、營8433、富禾5號(hào)、沈稻5號(hào)、沈稻6號(hào)、沈農(nóng)8801、沈稻4號(hào)、遼鹽糯10號(hào)和沈農(nóng)91只含有，沈農(nóng)159、鹽豐47、撫粳2號(hào)、清選1號(hào)和鹽粳22只含有；沈香糯1號(hào)和沈農(nóng)265只含有；旱9710只含有。旱糯303、遼粳27、沈農(nóng)702和沈農(nóng)87-913不含有檢測(cè)的9個(gè)抗性基因。

參試的水稻品種中共檢測(cè)到62個(gè)抗性基因組合類型，無明顯的地區(qū)差異。其中含有7個(gè)基因組合類型的品種超過10個(gè)，占總數(shù)的45.77%。東選2號(hào)等28個(gè)品種基因組合類型為和；莊育3號(hào)等11個(gè)品種基因組合類型為、和；沈稻81等19個(gè)品種基因組合類型為、和；遼粳534等13個(gè)品種基因組合類型為、、和；豐民2102等13個(gè)品種基含有基因；遼豐4號(hào)等24個(gè)品種基因組合類型為和；遼粳6號(hào)等11個(gè)品種基因組合類型為、和。參試水稻品種平均4.19個(gè)品種抗性基因類型是一樣，抗病基因組合類型不夠豐富。

參試品種中糯稻和旱稻攜帶的抗性基因相對(duì)較少，260個(gè)品種中有糯稻品種12個(gè)，其中含有2個(gè)及以下抗性基因的品種有8個(gè)，占糯稻總數(shù)的66.67%。旱稻品種11個(gè)，含有2個(gè)及以下抗性基因的品種有6個(gè)，占旱稻品種的54.55%。

2.3 遼寧省粳稻品種基于稻瘟病抗性基因檢測(cè)聚類分析

對(duì)260份遼寧省粳稻品種進(jìn)行聚類分析（表4），抗病基因檢測(cè)有條帶的為1，無條帶的0，以歐氏距離15為閾值，可以將260份水稻品種分成11個(gè)類群。第Ⅰ類群包括港稻1號(hào)等11個(gè)品種，含有抗性基因、和，不含有、、和。第Ⅱ類群包括遼粳390等10個(gè)品種，含有、、和，不含有和。第Ⅲ類群包括鹽粳377等6個(gè)品種，含有、、和，不含有和。第Ⅳ類群包括祥豐00-93等5個(gè)品種，含有、和，不含、和。第Ⅴ類群包括營9207等95個(gè)品種，含有，不含有和。第Ⅵ類群包括遼星10號(hào)等26個(gè)品種，含有，不含有、、、和。第Ⅶ類群包括花粳45等50個(gè)品種，不含、、和。第Ⅷ類群僅包括丹粳12、遼星21和美鋒518，含、和，不含、和。第Ⅸ類群包括營稻1號(hào)等38個(gè)品種，含，不含、、和。第Ⅹ類群包括沈稻10號(hào)和公字1號(hào)，含和，不含、、、、和。第Ⅺ類群包括遼粳92-34等14個(gè)品種，含，不含、、和。

表2 9個(gè)稻瘟病抗性基因地域及品種分布頻率

LNRRI, Liaoning Rice Research Institute; PY, Panjin area and Liaoning Provincial Saline-Alkali Land Utilization and Research Institute; SN, Shenyang Agricultural University.

表3 遼寧省粳稻品種所含目標(biāo)基因數(shù)目及其所占比率

參試的260份水稻品種80.38%集中在第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ類群。其中，第Ⅵ類群中沈陽農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的品種僅千重浪1號(hào)；丹東地區(qū)育成的品種在第Ⅶ類群有2個(gè)品種，在第Ⅸ類群有10個(gè)品種；盤錦地區(qū)及鹽堿地研究所育成的品種在第Ⅶ類群有13個(gè)品種。類群中品種數(shù)量地域分布不均，沒有明顯的地域差異。

表4 基于抗病基因檢測(cè)的聚類分析結(jié)果

2.4 抗性單基因系抗病性評(píng)價(jià)

采用遼寧省4個(gè)生態(tài)稻區(qū)分離的38株強(qiáng)致病力稻瘟病菌對(duì)等9個(gè)抗性單基因系進(jìn)行苗期接種鑒定。結(jié)果表明，9個(gè)抗性單基因系抗性頻率均高于麗江新團(tuán)黑谷的抗性頻率（13.16%）?？剐灶l率大小依次為、、、、、、、和（表5）。

分蘗盛期和蠟熟期對(duì)4個(gè)田間自然誘發(fā)抗病圃的單基因系葉瘟和穗瘟進(jìn)行調(diào)查，9個(gè)抗性單基因系抗性均優(yōu)于LTH的抗性。其中，抗性單基因系、、、和抗性較好，綜合指數(shù)均小于2，達(dá)到抗（R）及以上級(jí)別?？剐詥位蛳悼剐宰畈畹模罡甙l(fā)病級(jí)別為7級(jí)，出現(xiàn)在DG穗期，綜合指數(shù)為6.5，達(dá)到感?。⊿）級(jí)別?？共位蛳?、、、和在遼寧省有很好的利用價(jià)值，尤其更適合盤錦和鐵嶺兩個(gè)生態(tài)稻區(qū)推廣利用。

3 討論

近20年來，稻瘟病平均每4~6年大發(fā)生一次，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，利用抗性基因培育抗性品種是解決這一問題的主要辦法。為了明確遼寧省粳稻品種稻瘟病抗性基因類型，本研究選用了9個(gè)稻瘟病抗性基因的特異引物對(duì)260個(gè)已審定品種進(jìn)行檢測(cè)，并分析了9個(gè)抗性單基因的抗病性。研究表明，遼寧省粳稻品種含有的基因數(shù)量從0~7個(gè)不等，抗性基因分布頻率最高，其次是和。基因簇的抗性基因分布頻率均較低，僅遼粳421檢測(cè)到，未檢測(cè)到任何品種中含有基因。Tian等[24]認(rèn)為抗病基因尚未在中國秈稻品種中廣泛應(yīng)用。汪文娟等[21]認(rèn)為華南328個(gè)雜交稻組合中不攜有抗病基因。本研究結(jié)果與兩者的結(jié)論相符。基因簇的4個(gè)抗性基因?qū)Ψ蛛x自遼寧省4個(gè)生態(tài)稻區(qū)的病原菌表現(xiàn)較強(qiáng)的抗性，抗性頻率為57.89%~89.47%，田間自然抗性情況表現(xiàn)為抗（R）及以上級(jí)別，與劉士平等[25]、吳憲等[26]、褚晉等[22]研究發(fā)現(xiàn)抗性基因?qū)Ψ坡少e、吉林、云南等地的病原菌均表現(xiàn)高抗性的結(jié)果一致。由此可以推斷基因簇的4個(gè)抗性基因在遼寧省水稻抗病育種中利用價(jià)值較高。

對(duì)于新品種而言，其產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性的突破主要依賴其親本材料遺傳多樣性的豐富程度。翟榮榮等[27]利用均勻分布于水稻12條染色體上的48對(duì)SSR引物可將浙江省主要推廣種植的10個(gè)常規(guī)晚粳稻品種劃分為兩類。張?jiān)频萚28]用SSR標(biāo)記分析中國水稻兩用核不育系現(xiàn)有骨干親本材料的遺傳多樣性。本研究基于抗性基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，將遼寧省已通過審定的260份粳稻材料分為11個(gè)類群，80.38%集中在第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ類群，參試品種共有62個(gè)基因組合類型，其中遼豐4號(hào)等24個(gè)品種，遼鹽9號(hào)等28個(gè)品種以及沈稻81等19個(gè)品種的抗稻瘟病基因型完全相同，說明參試的260份水稻品種抗病基因組合類型不豐富，親緣關(guān)系較近，差異較小。

利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)開展稻瘟病抗性育種取得較大進(jìn)展。聶元元等[29]將稻瘟病抗性基因、和導(dǎo)入到三系雜交稻恢復(fù)系R225，稻瘟病抗性顯著高于各自的輪回親本。張曉慧[30]將MP水稻材料中的廣譜抗稻瘟病基因片段導(dǎo)入空育131染色體組中，提高空育了131對(duì)稻瘟病的抗性。在本研究選定的9個(gè)抗病基因基礎(chǔ)上分析，遼寧省粳稻品種尤其是糯稻和旱稻品種抗性選育上應(yīng)選擇遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)的材料或者引入攜帶、、和基因的品種作為親本材料。

表5 抗性單基因系田間自然抗病性評(píng)價(jià)

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Analysis of Rice Blast Resistance Genes inRice Varieties in Liaoning Province

PAN Zhengyan1,2, QIU Fulin1, Lü Guilan1, MA Xiufang1, SHANG Wenqi1, BAI Yuanjun1,*, XU Zhengjin2,*

(,Corresponding author,:)

【Objective】To clarify the rice blast resistance genes in 260rice varieties in Liaoning Province, evaluate their utilization value, and provide reference for rice breeding,【Method】specific primers of nine rice blast resistance genes were selected to analyze the species, the quantity and the geographical distribution of resistance genes of 260rice varieties in Liaoning,and the cluster analysis of varieties was based on the detection bands of disease resistance genes. The disease resistance of the nine resistant mongenic rice lines was evaluated by seedling-spray inoculation, natural disease investigation during the active tillering stage and ripening stage.【Result】The number of blast resistance genes inrice from Liaoning varied from 0 to 7, and the frequency ofgene ranked highest, followed by theand.gene was not detected in all tested varieties, andgene was only detected in Liaojing 421 bred by the Liaoning Academy of Agricultural Sciences.There were 62 gene combinations in the rice varieties tested,and based on the clustering analysis of the results of the resistance gene detection, 260rice materials can be divided into 11 groups. Among the nine resistant mongenic lines,showed the best resistance, followed by,and.【Conclusion】The resistance genes,,, andhave important application potential in breeding in Liaoning Province. 80.38% of the tested varieties concentrate in groups V, VI, VII and IX.There is no obvious geographical difference; the types of disease resistance gene combinations of the tested varieties are relatively less abundant and the genetic relationship is relatively close.

rice; rice blast; resistance gene

S435.111.4+; S511.022

A

1001-7216(2019)03-0241-08

10.16819/j.1001-7216.2019.8071

2018-06-10；

2018-10-18。

遼寧省博士后項(xiàng)目(178150); 國家水稻產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系沈陽綜合試驗(yàn)站(CARS-01-50); 遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目(2014023)。