何婧 劉寒 郭留明 李靜 張恒木

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水稻小熱休克蛋白OsHSP20抗體特性鑒定及應用

何婧1, 2劉寒1, 2郭留明1, 2李靜2張恒木1, 2, *

(1浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004;2浙江省農業(yè)科學院 病毒學與生物技術研究所/省部共建植物有害生物國家重點實驗室培育基地, 杭州 310021;*通訊聯(lián)系人, E-mail: zhhengmu@tsinghua.org.cn)

【目的】在前期克隆了一個水稻小熱休克蛋白(OsHSP20)的基礎上，進一步分析該蛋白多克隆抗體的免疫反應特性和應用范圍，為深入鑒定該類基因的功能奠定基礎?！痉椒ā坷煤铣啥嚯暮推湓吮磉_產物分別免疫家兔制備了相應的多克隆抗體；ACP(Antigen-coated plate)-ELISA和dot-ELISA用于分析比較多克隆抗體效價和靈敏度；Western blot用于鑒定多克隆抗體的特異性和應用范圍?！窘Y果】Western blot分析顯示，利用重組OsHSP20蛋白及其合成多肽所制備的多克隆抗體均可以在原核表達OsSHSP樣品中特異性檢測到1條大小與預期一致(37 kD)的條帶，表明兩種方法獲得的多克隆抗體都具有高度的特異性；ACP(Antigen-coated plate)-ELISA和dot-ELISA分析表明，利用重組蛋白制備的多克隆抗體效價和靈敏度均高于利用多肽制備的抗體。進一步的Western blot分析顯示該抗體可用于多種植物小熱休克蛋白(SHSP)的檢測。【結論】制備了OsHSP20蛋白質抗體，且具有高度的特異性和較高的效價和靈敏度，可廣泛地用于多種單、雙子葉植物HSP20蛋白的表達分析，有助于OsHSP20及其他植物同源蛋白的功能鑒定。

小熱休克蛋白；多克隆抗體；蛋白質印跡法

熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)是生物體細胞受到高溫等外界非生物條件刺激時產生的一類結構保守的分子伴侶蛋白，分子量大小分布為10~200 kD,其中小熱休克蛋白(small heat shock protein，SHSP)的分子量大小一般在15~30 kD，且在充當分子伴侶時不依賴ATP[1-2]。作為生物抗逆重要防線的SHSP廣泛存在于各類生物細胞中且含量豐富，在重金屬、干旱、冷凍和氧化脅迫等諸多非生物逆境以及細胞凋亡、分化等發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能[3-5]。與動物SHSP相比，植物SHSP種類更為豐富多樣，進化過程也更為復雜；進化樹分析和亞細胞定位預測表明植物SHSP 至少可分為14個亞類(subfamilies)，不同亞類的SHSP 可能定位于不同的細胞器，不同的亞細胞器定位在一定程度上反映了植物SHSP功能多樣性[6]。最近的報道顯示，植物SHSP 不僅參與保護植物免受非生物逆境的傷害，還可能參與病毒等生物逆境響應過程[7]，但對于它們的功能機制仍然了解很少。

在前期的研究中，本實驗室在研究水稻條紋病毒與水稻互作的過程中發(fā)現(xiàn)病毒侵染可改變小熱休克蛋白在水稻細胞內的定位和分布模式，并且水稻條紋病毒復制酶可特異性地與一個水稻小熱休克蛋白(OsHSP20)在細胞質中相互作用，表明該OsHSP20可能參與病毒侵染宿主水稻的過程[7]。生物信息學分析顯示OsHSP20在分類上隸屬于CI 類, 其C端部分(52~143 aa) 具有保守的α-晶體蛋白結構域(α-crystallin domain，ACD)，類似的結構多存在于小熱休克蛋白及其他分子伴侶蛋白[8-9]；定量分析顯示熱激處理和病毒侵染都顯著影響該基因的表達[7,10]；非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示該蛋白在體外能形成同源二聚體或寡聚體，支持該蛋白可能通過形成同源寡聚體的方式發(fā)揮其分子伴侶活性[11]。為了進一步分析OsHSP20的特性，本研究在前期克隆和原核表達的基礎上進一步通過合成多肽和純化的異源重組表達產物作為抗原制備了該蛋白的多克隆抗體，并對其效價、靈敏度和特異性進行比較分析，以期為深入鑒定植物SHSP特性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

基因及其原核表達載體均由本實驗室克隆、構建并保存[10-11]。免疫學實驗使用的堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)、AP標記的羊抗兔IgG二抗、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗兔等均購自上海生工生物工程股份有限公司；水稻()和本氏煙()種子由本實驗室保存，玉米()、辣椒()、蘿卜()、青菜(Linn.)、白菜(Rupr)、生菜()等蔬菜種子購自浙江勿忘農種業(yè)公司并按商家說明培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱，熱激處理植物材料的條件為45℃、2 h。

1.2 重組蛋白表達與純化

將含有基因的表達載體質粒(pET-OsHSP20)轉化至表達菌株BL21(DE3)，并接種于含氨芐抗生素的固體 LB 培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)過夜；第二天轉接至大量液體培養(yǎng)基，以180 r/min轉速振蕩培養(yǎng)，當600值約 0.6 時加入異丙基-β--硫代半乳糖苷(IPTG)繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，離心收集菌體，經超聲波裂解后，在4℃、12 000 r/min下離心25 min，收集上清；再按照試劑盒說明書，通過鎳柱從上清液中親和層析純化重組蛋白。

1.3 多肽抗原設計與合成

根據(jù)OsHSP20蛋白的氨基酸序列[10]，應用B細胞表位預測程序ABCpred[12]篩選多肽表位“DQWHRVERSSGKFLR”，該多肽經化學合成后偶聯(lián)至載體蛋白KLH(Keyhole limpet hemocyanin)上用作抗原(AB-LIND公司合成)。

1.4 抗體制備和純化

多肽抗原和純化蛋白抗原分別溶于磷酸鹽(PBS)緩沖液，加入等體積福氏免疫佐劑，經完全乳化后作為免疫抗原。然后采用腹腔多點皮下注射的方法免疫家兔，免疫3次后，采集抗血清并按照商家說明利用親和層析柱法純化抗體。

1.5 酸性磷酸酶-酶聯(lián)免疫吸附試驗(ACP-ELISA)

ACP-ELISA參照文獻[13]的方法進行，具體步驟如下：蛋白樣品經包被液稀釋后，取100 μL加入96孔板中，4℃下包被過夜；包被后的96孔板，用抗體稀釋液(PBST)清洗3次；加入250 μL封閉液(5％脫脂奶粉；5 g奶粉加入100 mL 1×PBS溶液中溶解)， 37℃下封閉0.5 h；封閉后，PBST清洗，每孔加入100 μL一抗稀釋液，37℃下反應1 h，PBST清洗3次，每次3 min；每孔加入100 μL酶標二抗稀釋液，37 ℃下反應1 h；PBST清洗后，每孔加入100 μL顯色液，顯色30~60 min；用酶標儀測定OD405值。

1.6 斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗(dot-ELISA)

dot-ELISA法參照文獻報道[14]的方法，略有修改。取2 μL蛋白樣品點樣至硝酸纖維膜上，室溫干燥10~20 min，將點樣后的硝酸纖維膜移至PBS封閉液(含5％脫脂奶粉)孵育1 h；棄去封閉液，用PBS洗膜3次，再加入含一抗的稀釋液室溫下反應1 h，用PBS洗膜3次后，于二抗稀釋液中反應1 h；洗膜3次后，加入NBT-BICP進行顯色反應。

1.7 SDS-PAGE和Western blot

植物組織用液氮研磨成粉末，加入細胞裂解液(含0.15 mol/L Tris-HCl，6% SDS，2% β-巰基乙醇)，離心取上清，即為植物總蛋白。提取的總蛋白或純化蛋白經SDS-PAGE(濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12%)電泳[15]后，采用半干移印系統(tǒng)(BIO-RAD公司)通過電轉移法將蛋白轉至硝酸纖維膜(美國GE公司)。經蒸餾水清洗后，將膜放入含5%奶粉的PBS中室溫封閉1 h；用PBS洗膜3次后，加入一抗稀釋液，室溫下反應1 h；用PBS洗膜3次，加入二抗稀釋液，室溫下反應1 h；再用PBS洗膜3次。然后利用eECL Western Blot 試劑盒(Millipore公司)按照商家說明進行顯色反應，應用Amersham imager 600(美國GE公司)成像系統(tǒng)獲取圖像信號。

2 結果與分析

2.1 OsSHSP蛋白表達純化及其多克隆抗體特異性分析

為了表達OsHSP20，將重組質粒pET-OsHSP20轉化至表達菌株BL21 (DE3)誘導表達1~3 h后進行SDS-PAGE檢測分析。在含重組質粒pET-OsHSP20 的誘導表達菌株樣品中均存在一條與重組蛋白預期分子量大小一致的染色較深的條帶(第3~5泳道)，約為37 kD，而僅含空載體質?；蚝亟M質粒但未經誘導的宿主菌樣品中則不存在對應的條帶(圖1-A)；采用鎳柱親和層析方法從上清液中可成功純化該重組蛋白(圖1-A)，表明OsHSP20重組蛋白獲得正確表達，且1~3 h的誘導表達效果無顯著差異。

利用重組表達純化的全長OsHSP20蛋白及合成的肽段分別免疫家兔，制備了兩種多克隆抗體。為便于描述，將由重組全長蛋白制備的多克隆抗體命名為L抗體；由合成短肽制備的多克隆抗體稱為S抗體。為了分析抗體的特異性，分別以L抗體和S抗體作為一抗進行Western blot分析（圖1-B和C）。兩種方法所制備的抗體在誘導表達OsHSP20重組蛋白的宿主菌裂解物樣品和純化的OsHSP20重組蛋白樣品中均檢測到一條大小一致的信號條帶，而在不含重組載體質粒的對照大腸桿菌裂解物樣品中均未檢測到反應信號。因此，本研究所制備的兩種多克隆抗體均能夠與目標重組蛋白發(fā)生免疫學反應且條帶單一，具有良好的特異性。

M為蛋白標記；第1、7、9泳道為誘導的含空載體的E coli BL21(DE3) 宿主菌樣品；第2泳道為未誘導的含OsHSP20的宿主菌；第3~5泳道分別為誘導1、2、3 h含OsHSP20的宿主菌；第6泳道為純化的HSP20蛋白；第8、10泳道為誘導1 h含OsHSP20的宿主菌。

Fig. 1. Analysis of recombinant OsHSP20 (A) and specificity of L and S antibodies (B and C) by SDS-PAGE and Western blot.

2.2 ACP-ELISA法測定抗體效價

測定兩種抗體的效價，發(fā)現(xiàn)應用純化的重組蛋白制備的抗體效價達到1∶512000(圖2-A)，應用合成肽段方法制備的抗體效價1∶4000(圖2-B)。相比之下，應用純化的OsHSP20重組蛋白所制備抗體的效價明顯高于應用合成多肽所制備抗體。

2.3 dot-ELASA法分析抗體的靈敏度

為了比較上述兩種抗體的靈敏度，將純化的0.5 μg OsHSP20重組蛋白進行梯度稀釋，依次點至硝酸纖維膜上進行斑點雜交實驗，結果如圖3所示。兩種抗體均無法識別牛血清白蛋白(BSA)，但均能有效識別稀釋至64倍的重組蛋白抗原(8 ng)；但當重組蛋白抗原稀釋至256倍(2 ng)時，S抗體已經檢測不到信號，因此S抗體的檢測靈敏度約8ng；而L抗體一直可有效識別稀釋至256倍的抗原，表明其靈敏度可高達2 ng。

圖2 ACP-ELISA法分析L抗體(A)和S抗體(B)的效價

Fig. 2. Titer examination of L (A) and L (B) antibodies by ACP-ELISA.

圖A、B中均為16組斑點雜交實驗，每組3個實驗重復。

Fig. 3. Sensitivity analysis of L (A) and S (B) antibodies by dot-ELISA.

2.4 在檢測植物HSP20中的應用

為了應用OsHSP20多克隆抗體，我們提取水稻總蛋白并以效價和靈敏度均較高的L抗體為一抗進行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)在45℃熱激處理2 h的水稻樣品中可特異性地檢測到一條顯色較強的條帶，且分子量與預期大小一致，而未熱激處理的水稻樣品中則未檢測到相應的條帶(圖4)。說明該蛋白是熱激誘導蛋白，可能在高溫脅迫逆境中發(fā)揮作用。為了確定L抗體是否能應用于其他植物HSP20的檢測，分別從45℃熱激處理2 h的玉米、本氏煙、辣椒、大白菜、生菜、青菜、蘿卜等植物樣品中提取了總蛋白，并進行Western blot分析(圖4)。L抗體在所檢測的熱激處理樣品中，均可檢測到大小一致的條帶，而在未熱激處理的植物樣品也未檢測到任何信號，這些結果表明對應的植物HSP20與OsHSP20一樣，在正常生長條件下表達水平極低，甚至檢測不到，而在高溫逆境條件下高水平表達，支持該蛋白在高溫逆境下發(fā)揮重要功能的推論；同時也表明本研究所制備的多克隆抗體可廣泛地用于檢測植物HSP20。值得注意的是，不同植物中的雜交信號有強弱，可能反映這些植物的HSP20和OsHSP20的同源性存在一定程度上的差異。

3 討論

抗體是研究蛋白功能的前提條件之一，OsHSP20是一類在溫度逆境下發(fā)揮重要作用的功能蛋白，目前尚未見有關OsHSP20抗體的報道。以KLH偶聯(lián)的合成多肽作為抗原是當前常用的制備抗體的方法之一，相比以完整蛋白為抗原的抗體制備方法而言，該方法也有一定的優(yōu)勢，如簡單快速且易獲得多肽特異性抗體[16]。因此，近年來，該方法應用也較為廣泛。本研究應用該方法制備的S抗體表現(xiàn)出良好的特異性(圖1-C)；但從效價和靈敏度來看，以純化的重組蛋白作為抗原所制備的L抗體具有明顯的優(yōu)勢，因此完整的OsHSP20中可能存在豐富的表位，從OsHSP20中篩選免疫原性更好的表位可能有助于進一步提高用KLH-多肽為抗原所制備抗體的效價和靈敏度。

ACP-ELISA和dot-ELISA是常用的檢測抗體效價和靈敏度的方法，本研究采用dot-ELISA法檢測兩種抗體的效價，結果表明L抗體效價較高。但根據(jù)以上結果可知dot-ELISA方法檢測的效價明顯比間接ELISA方法高，其原因可能是由于ACP-ELISA中使用的聚苯乙烯酶標板與抗原抗體復合物結合能力較弱；而dot-ELISA中使用的硝酸纖維膜對蛋白質的親和力更高[17-18]。如此，我們在靈敏度檢測時選擇dot-ELISA方法。有關植物HSP20抗體的研究鮮有報道，本研究制備的OsHSP20抗體，為研究該蛋白功能奠定了良好的基礎；同時證實了該抗體可廣泛應用于多種植物來源的同源基因的檢測分析，拓寬該抗體的應用范圍，為直接探索其他植物來源的同源基因功能提供了特異性抗體材料。

M為蛋白Marker；HS?熱激處理；Os?水稻；Nb?本氏煙；Zm?玉米；Ca?辣椒；So?生菜；Ec?重組表達OsHSP20蛋白的菌株；Bc?青菜；Rs?蘿卜；Bp?大白菜。

Fig. 4. Detection of HSP20s with Western blot in different plant samples.

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Characterization and Application of Antibodies Against a Small Heat Shock Protein OsHSP20 from

HEJing1, 2, LIU Han1, 2, GUO Liuming1, 2, LI Jing2, ZHANG Hengmu1, 2, *

(College of Chemistry and Life Science,,,;/,,,;*Corresponding author,:)

【Objective】In previous studies,, a gene encoding small heat shock protein, was cloned from. Here its polyclonal antibodies were prepared and analyzed for their properties of immunological reactions and range of application. 【Method】 Synthetic peptide and recombinant protein of OsHSP20 were used to immunize the rabbits for preparing the polyclonal antibodies against the protein, respectively. Antigen-coated plate (ACP)- and dot-enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) were used for comparing the titer and sensitivity of antibodies. Western blotting was used to determine the antibody specificity and the range of application. 【Result】In Western blotting assays, both antibodies were strongly reacted with a band of protein with an expected size of 37 kD, suggesting that they were specific against the OsHSP20. ACP- and dot-ELISA assays showed that the polyclonal antibody prepared from the recombinant protein had a higher titer and sensitivity than that of peptide. Further assays showed that the polyclonal antibody could be used for detection of the SHSP homologs of plants. 【Conclusion】The polyclonal antibodies were successfully prepared with high specificity, titer, and sensitivity and could be widely used to analyze the expression of HSP20 protein in a variety of monocotylous and dicotyledonous plants, which could contribute to the functional characterization of OsHSP20 and its homologs in different plants.

small heat shock protein; polyclonal antibodies; Western blot

Q785; S511.01

A

1001-7216(2019)03-0235-06

10.16819/j.1001-7216.2019.9009

2019-01-21；

2019-02-17。

國家自然科學基金資助項目(31601603)；浙江省重點研發(fā)計劃資助項目(2019C02018)。