文藝 方云霞 胡鵬 王月影 侯琳琳 譚義青 朱黎欣 鄧雪梅 曾大力 張光恒 郭龍彪 朱麗 陳光 任德勇 饒玉春 薛大偉 錢前 胡江,

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水稻窄葉突變體的鑒定與基因精細(xì)定位

文藝1, 2,#方云霞3,#胡鵬2王月影2侯琳琳2譚義青2朱黎欣2鄧雪梅2曾大力2張光恒2郭龍彪2朱麗2陳光2任德勇2饒玉春1薛大偉3錢前1, 2,*胡江2,*

(1浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 金華 321000;2中國水稻研究所 水稻生物學(xué)國家重點實驗室, 杭州 310006;3杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 杭州 310036;#共同第一作者;*通訊聯(lián)系人, E-mail: qianqian188@hotmail.com; hujiang588@163.com)

【目的】水稻葉片是理想株型的主要組成部分。篩選和鑒定新的葉形突變材料，可為研究葉發(fā)育調(diào)控機制和塑造葉片理想形態(tài)打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坑删酒贩N武運粳31經(jīng)EMS(ethyl methane sulphonate)誘變獲得窄葉突變體()；通過表型測量分析劍葉至倒4葉的葉片長度、寬度、大脈數(shù)和小脈數(shù)，并進(jìn)行組織切片和顯微觀察；將突變體與秈稻品種臺中本地1號(TN1)雜交，在F2分離群體中選取了1709個具窄葉突變表型的單株，通過已有的SSR、STS和新開發(fā)的分子標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位?！窘Y(jié)果】在幼苗期就表現(xiàn)出了窄葉性狀，在成熟期植株較野生型矮小，分蘗增多，莖稈變細(xì)。經(jīng)組織切片觀察分析，葉片變窄是由于大脈和小脈數(shù)量減少造成。遺傳分析表明該窄葉表型受單一隱性核基因調(diào)控；最終將該基因定位在第10染色體上LC2-RF37與LC4R-RF39標(biāo)記之間約64.7 kb的范圍內(nèi)。該區(qū)間內(nèi)共有10個開放閱讀框，其中并無已報道的窄葉相關(guān)基因。qRT-PCR結(jié)果表明，基因的突變會影響生長素合成與運輸相關(guān)基因的表達(dá)。【結(jié)論】為一個新的葉形調(diào)控基因。這為進(jìn)一步研究水稻葉片發(fā)育，豐富其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)打下了基礎(chǔ)。

水稻；窄葉；；基因定位

葉片作為水稻光合作用和呼吸作用的主要器官，其形態(tài)結(jié)構(gòu)直接影響水稻的生長發(fā)育和最終產(chǎn)量[1]。因此，深入研究水稻葉發(fā)育的分子調(diào)控機制，建立相應(yīng)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，塑造大田種植的最佳葉片形態(tài)，對提高水稻產(chǎn)量和改善稻米品質(zhì)均有重要的理論意義和應(yīng)用價值。作為水稻理想株型的重要組成部分，葉片大小和受光姿態(tài)一直是育種學(xué)家關(guān)注的重點。袁隆平針對長江中下游稻作區(qū)超級雜交水稻的理想株型，強調(diào)葉片要“長、直、窄、凹、厚”，充分發(fā)揮冠層在整個生育期的光合作用來提高產(chǎn)量[1]。也即應(yīng)根據(jù)不同地區(qū)和氣候條件選擇相應(yīng)葉片形態(tài)，在同等光照下最大限度地保證每片葉的受光面積，提升光合效率，從而提高產(chǎn)量。

到目前為止，已有多個水稻窄葉突變基因被發(fā)掘和克隆。通過經(jīng)典遺傳結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，已經(jīng)定位窄葉基因~，其中、、、和已經(jīng)被克隆[2-5]。此外還有一些窄葉相關(guān)基因，如窄卷基因[6-8]和[9-11]，白化窄葉基因/等[12-13]。其中，編碼一個生物學(xué)功能未知蛋白，在維管束組織中大量表達(dá)，其突變后可引起葉片中小脈數(shù)顯著減少從而導(dǎo)致葉寬變小[12-13]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)是通過降低生長素的極性運輸來調(diào)控葉發(fā)育，其在9311中的等位基因()可提高葉綠素含量，并增加產(chǎn)量[14]。和是拷貝基因，與擬南芥中的和玉米中的、同源，均編碼與WUSCHEL相關(guān)的同源框蛋白OsWOX3A，也是通過生長素極性運輸來調(diào)控葉片的發(fā)育[3]。編碼一個含核黃素的單加氧酶，是YUCCA家族中的一員，涉及到生長素的生物合成，該基因的突變可導(dǎo)致生長素含量的變化，最終影響葉寬[4]。而與水稻黃葉基因等位，同時調(diào)控著水稻葉綠體的發(fā)育和葉寬[5]。窄卷葉基因() 編碼一個纖維素合成類似酶OsCSLD4，在根、葉鞘、穗部等生長旺盛的器官中大量表達(dá)，該基因能夠通過影響維管束和泡狀細(xì)胞的發(fā)育來調(diào)控葉片的寬度和卷曲度[6-8]。/編碼CHR4/MI-2類似蛋白，是一類可調(diào)節(jié)H3K4和H3K27甲基化的基因，該基因也是通過調(diào)控生長素來影響水稻葉片維管束發(fā)育的[12-13]。

本研究以新窄葉突變體為材料，通過構(gòu)建的F2群體進(jìn)行遺傳分析，并利用已知的分子標(biāo)記和新開發(fā)的分子標(biāo)記開展了目的基因的精細(xì)定位，將其鎖定在第10染色體長臂末端約64.7 kb的區(qū)域內(nèi)。同時還開展了組織切片觀察，以及生長素相關(guān)基因的qRT-PCR表達(dá)分析。這些將為進(jìn)一步的基因克隆和解析其調(diào)控葉發(fā)育的分子機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

粳稻品種武運粳31經(jīng)EMS誘變，從其分離后代中獲得一個窄葉突變體，經(jīng)連續(xù)多代種植，突變性狀能夠穩(wěn)定遺傳。將與秈稻品種臺中本地1號(TN1)雜交得到F1，播種自交得到F2分離群體，從中分離出現(xiàn)正常和窄葉兩種表型，根據(jù)窄葉表型田間取樣，共獲得1709個窄葉材料用于基因定位。所有水稻材料均種植于杭州富陽中國水稻研究所試驗田。

1.2 表型調(diào)查與顯微觀察

抽穗后分別調(diào)查野生型與劍葉至倒4葉的葉長和葉寬、莖節(jié)長及分蘗數(shù)，在顯微鏡下統(tǒng)計葉脈數(shù)量。用FAA固定液(70%酒精、40%甲醛和冰乙酸的體積比為18∶1∶1)固定劍葉，經(jīng)酒精梯度脫水，二甲苯透明后用石蠟包埋，切片染色中性樹脂封片后用顯微鏡觀察維管束細(xì)胞，并拍照。

1.3 水稻DNA提取及PCR

野生型和兩個親本、F2群體及混池的DNA提取采用CTAB法。引物設(shè)計使用Primer Premier 5.0軟件，由尚亞生物技術(shù)公司合成。PCR采用10 μL擴增體系：2 μL模板DNA，1 μL dNTP(2 mmol/L)，1 μL緩沖液(10×)，2 μL 正反向引物，0.1 μL rDNA聚合酶，3.95 μL ddH2O。PCR擴增程序如下：94℃下高溫變性4 min；94℃下30 s，55℃下30 s，72℃下30 s，共計40個循環(huán)；72℃下充分延伸10 min，15℃下保存。PCR產(chǎn)物加入溴酚藍(lán)核酸染料，瓊脂糖凝膠電泳后置于凝膠成像儀上紫外掃描，保存膠圖并統(tǒng)計分析。

1.4 NAL12的精細(xì)定位

以1709株×臺中本地1號的F2隱性單株為定位群體，利用均勻分布于12條染色體上的SSR標(biāo)記對群體DNA混池（F2群體中隨機選取30單株)、F1以及雙親進(jìn)行多態(tài)性篩選，找出與目的基因連鎖的分子標(biāo)記。然后擴大群體驗證連鎖標(biāo)記，確定初定位區(qū)間?；诔醵ㄎ唤Y(jié)果，對比目標(biāo)區(qū)間內(nèi)秈粳基因組序列，以日本晴與珍汕97為參考，找出序列差異后用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計InDel標(biāo)記引物。PCR擴增雙親和瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出多態(tài)性引物對F2群體進(jìn)行檢測。分析膠圖，將具有臺中本地1號帶型的單株記為A，具有帶型的單株記為a，具有F1帶型即交換單株記為H，統(tǒng)計交換單株的減少趨勢及走向，以明確目標(biāo)基因的區(qū)間，依據(jù)圖位克隆原理完成精細(xì)定位。利用NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫（http://rice.plantbiology.msu.edu/）預(yù)測定位區(qū)間內(nèi)的候選基因，并下載其DNA序列。以候選基因序列為參考，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計測序引物，PCR擴增野生型和突變體，并送往尚亞生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。采用Seqman軟件比對分析測序結(jié)果。

1.5 實時熒光定量PCR

取野生型與突變體成熟植株的劍葉，使用Axygen公司的Miniprep試劑盒提取基因組RNA。隨后用日本TOYOBO公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace quantitative PCR RT Master Mix)反轉(zhuǎn)合成第1鏈cDNA，實驗操作均按照說明書進(jìn)行。得到cDNA后，稀釋5倍用于實時熒光定量PCR。使用Bio-Rad CFX96 PCR儀器和TOYOBO生產(chǎn)的2×SYBR Green PCR Master Mix試劑，擴增以水稻內(nèi)參基因作為對照，樣品3次重復(fù)，PCR擴增程序如下：95℃下預(yù)變性60 s；95℃下變性15 s，60℃下延伸60 s，共計40個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 nal12農(nóng)藝性狀分析

比較野生型武運粳31與窄葉突變體植株形態(tài)，兩者在葉片、莖稈、株高、分蘗和穗等方面存在顯著差異(圖1)。播種10 d左右，即可觀察到葉片顯著變窄，但根系發(fā)育正常(圖1-A)。抽穗后，株型緊湊，相對野生型稍矮小，分蘗數(shù)比野生型增多33.33%，葉片平均寬度和平均長度均低于野生型(圖1-B)；突變體莖稈變細(xì)，倒Ⅰ節(jié)至倒Ⅳ節(jié)長度分別為野生型的55.6%，55.8%，69.5%，88.1%(圖1-C、D、F)，穗形較小(圖1-E)。這表明該基因突變后不僅影響葉形態(tài)，而且早期就開始調(diào)控著整個植株的形態(tài)發(fā)育。

2.2 nal12細(xì)胞學(xué)觀察及組織解剖分析

調(diào)查統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，的葉寬與葉長均低于野生型，其劍葉至倒4葉的葉寬分別占野生型葉寬的58.8%、56.3%、53.3%和40.0%；而葉長則分別占野生型葉長的56.2%、66.4%、83.1%和80.0%(圖2-A、G、H)。由于已報道的窄葉相關(guān)基因大部分與葉片維管束的發(fā)育相關(guān)，我們進(jìn)行了顯微鏡及石蠟切片觀察，發(fā)現(xiàn)葉片劍葉至倒4葉的大脈數(shù)分別占野生型大脈數(shù)的83.3%、83.3%、66.7%和66.7%；而小脈數(shù)則分別占野生型小脈數(shù)的69.8%、57.8%、58.5%和62.5%，野生型與突變體的差異均達(dá)顯著水平(圖2-B~F、I、J)。因此，葉片的窄化應(yīng)該是葉脈數(shù)量下降造成的。

A?10 d秧齡的幼苗，標(biāo)尺=3 cm；B?分蘗期植株，標(biāo)尺=5 cm；C?穗，標(biāo)尺=1 cm；D和E?分別為莖稈倒Ⅰ節(jié)到倒Ⅵ節(jié)，標(biāo)尺=1 cm；F圖中，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差（n=20），**表示差異達(dá)0.01顯著水平。

Fig.. 1. Phenotype of wild-type Wuyunjing 31 and mutant.

A?野生型武運粳31和突變體nal12劍葉至倒4葉的形態(tài), 標(biāo)尺＝1 cm；B?葉片的主脈、大脈和小脈。MV為主脈，LV為大脈，SV為小脈，標(biāo)尺＝1 cm；C和D?主脈的石蠟切片，標(biāo)尺＝200 μm；E和F?大脈和小脈的石蠟切片。標(biāo)尺＝200 μm；G和H?野生型武運粳31和突變體nal12的葉寬和葉長；I和J?野生型武運粳31和突變體nal12的大脈數(shù)和小脈數(shù)。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差（n=20），**0.01極顯著水平。

Fig.. 2. Leaf microstructure of Wuyunjing 31(wild type, WT) and mutant.

2.3 遺傳分析與基因定位

本研究將突變體與秈稻臺中本地1號(TN1)雜交，得到的F1代在田間種植為正常葉片表型，表明該性狀受隱性基因控制。收集F1種子在田間播種，可分離出窄葉表型植株和正常表型植株。統(tǒng)計正常植株與窄葉植株的數(shù)量比例為5213∶1709，經(jīng)卡方測驗符合一對隱性核基因調(diào)控的3∶1分離比(χ2=0.34<χ20.05=3.84)，表明表型受一單隱性核基因控制。以184個F2隱性個體為初定位群體，利用234個均勻分布于12條染色體上的分子標(biāo)記進(jìn)行混池鑒定分析，發(fā)現(xiàn)在第10染色體末端位置，分子標(biāo)記B10-13、B10-14和B10-15的擴增條帶位置出現(xiàn)了偏擴增。隨后用這184個單株進(jìn)行驗證，結(jié)果表明3個分子標(biāo)記均與目標(biāo)性狀連鎖，初步將目的基因鎖定在第10染色體長臂末端(圖3-A)。然后擴大F2定位群體，共計1709株突變體表型單株，并在此區(qū)間進(jìn)一步設(shè)計SSR和InDel標(biāo)記，篩選出親本間具有多態(tài)性的分子標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位，最終將定位在標(biāo)記LC2-RF37和LC4R-RF39之間，物理距離為64.7 kb(圖3-B，表1)。據(jù)前人相關(guān)報導(dǎo)并未在此區(qū)段發(fā)現(xiàn)類似的窄葉基因，此為一個新的窄葉基因，定名為。

A?NAL12初定位在第10染色體上；B?NAL12精細(xì)定位在64.7 kb的區(qū)間內(nèi)；C?定位區(qū)間的10個預(yù)測基因。

Fig.. 3. Fine mapping of.

表1 用于基因定位和定量分析的分子標(biāo)記

表2 目標(biāo)區(qū)域預(yù)測基因

2.4 預(yù)測候選基因

根據(jù)水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(Rice Genome Annotation Project, http://rice.plantbiology.msu.edu/) 提供的信息，在的定位區(qū)間內(nèi)共包含10個預(yù)測基因，分別為LOC_Os10g42690，編碼一個結(jié)構(gòu)域蛋白；LOC_Os10g42700，編碼假定的CS結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)；LOC_Os10g42710，編碼RCD1酶；LOC_Os10g42720，編碼假定的酰基轉(zhuǎn)移酶；LOC_Os10g42724，編碼VHS和GAT結(jié)構(gòu)域蛋白；LOC_Os10g42730和LOC_Os10g42754，均編碼一個未知蛋白；LOC_Os10g42750，編碼CSLD1纖維素合成酶；LOC_Os10g42760，編碼一個PPR重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白；LOC_Os10g42770，編碼假定的a_IG002N01.7蛋白(圖3-C，表2)。

2.5 生長素相關(guān)基因的表達(dá)分析

根據(jù)已克隆基因的cDNA序列設(shè)計引物用于qRT-PCR(表1)。我們檢測了生長素相關(guān)基因在野生型武運粳31與窄葉突變體中的表達(dá)情況(圖4)。實驗結(jié)果表明，除生長素運輸基因外，其他基因的轉(zhuǎn)錄水平在中均有所下降。其中，生長素合成基因的表達(dá)量下調(diào)為野生型的61.6%；信號傳導(dǎo)有關(guān)基因的表達(dá)量下調(diào)為野生型的85.8%；運輸有關(guān)基因和分別下調(diào)為野生型的74.3%和49.8%。表明的基因突變可造成生長素的生物合成、運輸和傳導(dǎo)基因的改變，從而導(dǎo)致植株和葉發(fā)育的異常。

3 討論

本研究從武運粳31的EMS誘變?nèi)后w中獲得的一個窄葉突變體，其不僅表現(xiàn)為葉脈數(shù)量的顯著下降，還伴隨著植株矮化、分蘗增多、莖稈變細(xì)等表型，也即相關(guān)調(diào)控基因應(yīng)該是在多組織中表達(dá)的。根據(jù)已報道窄葉材料的表型，大部分突變體除了葉片變窄外，多數(shù)還伴隨著植株矮小、穗發(fā)育不良、葉片卷曲黃化等形態(tài)學(xué)特征。其中，、、和除了葉片變窄以外，還表現(xiàn)出植株矮化[2, 4-8]；而、和則表現(xiàn)出不同程度葉片卷曲[4, 6-12]。在葉色方面，的葉片為白條葉[12-13]，為黃化葉[5]，而顯性窄葉突變體的葉片則表現(xiàn)為深綠色[15]。此外，窄葉突變體還會出現(xiàn)畸穎，并且不育[16]。因此，與其他窄葉材料一樣，均有多個性狀發(fā)生變化，表明其突變基因可同時影響植株多個組織器官的發(fā)育。

Bar值代表標(biāo)準(zhǔn)誤（n=3），**表示0.01極顯著水平，*表示0.05顯著差異。

Fig.. 4. Expression analysis of auxin-related genes in the wild-type Wuyunjing 31 and mutant.

通過圖位克隆法，我們將精細(xì)定位在第10染色體末端約64.7 kb的區(qū)間，該區(qū)域內(nèi)有10個預(yù)測基因。其中編碼一個OsCSLD1蛋白，涉及到根毛的發(fā)育[17]。在高等植物中，糖基轉(zhuǎn)移酶家族的纖維素合酶類似蛋白(cellulose synthase-like, CSL)對細(xì)胞壁的生物合成和植株生長至關(guān)重要。家族參與纖維素與半纖維素的骨架合成，在水稻中有5個成員，即~；在擬南芥中有6個成員，即~[6]。其中，編碼一個OsCSLD4蛋白，該基因的突變會導(dǎo)致植株矮化、窄葉微卷及細(xì)長粒表型[6-8]。而/則是與水稻根毛的形態(tài)建成相關(guān)，在根部和地上部分外皮層和皮層細(xì)胞的細(xì)胞壁表達(dá)，該基因突變后可造成根毛縮短或無根毛表型，但根系長度及地上部表型無顯著性變化[17-18]。盡管定位區(qū)間內(nèi)包含基因，但與/的突變表型顯著不同，/表型為無或短根毛，植株和葉形正常，而則表現(xiàn)出了矮化、窄葉、分薛增多、細(xì)稈，且根毛正常表型，表明應(yīng)為一個調(diào)控葉片發(fā)育的新基因。

葉片從葉原基起始開始，經(jīng)近-遠(yuǎn)軸、基-頂軸和中-側(cè)軸三個極性發(fā)育方向發(fā)育，最終形成一片完整的葉，而葉片寬窄改變應(yīng)與中-側(cè)軸的極性發(fā)育相關(guān)。通過解剖分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)窄葉都發(fā)生了葉脈數(shù)量的減少，如和就會使大脈和小脈減少，經(jīng)組織切片后能觀察到突變體的維管束發(fā)育不完全，其數(shù)目和分布皆有所改變[2, 4]。與生長素極性運輸相關(guān)[2]，而則與生長素合成相關(guān)[4]，事實上生長素對于細(xì)胞分裂、分化、縱向延伸以及葉原基的分化均有著重要作用[19-20]。在RT-PCR分析中，中的生長素合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及運輸基因的表達(dá)基本都下降了，表明很可能也涉及到通過生長素調(diào)控葉發(fā)育。

目前，由于突變發(fā)生的不確定性，通過誘變育種來進(jìn)行品種改良往往都伴隨著一些不利性狀，如生育期延遲、植株矮化、葉片過于卷曲、結(jié)實率下降等，導(dǎo)致多數(shù)突變材料，特別是葉形類材料并不能直接用于育種改良。然而通過挖掘和鑒定新葉形突變材料，克隆相關(guān)控制基因，完善其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，再通過基因敲除或定點突變等新興技術(shù)將為構(gòu)造水稻理想株型的分子育種打下基礎(chǔ)。

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Identification and Fine Mapping of a Narrow Leaf Mutantin Rice

WEN Yi1, 2,, FANG Yunxia3,, HU Peng2, WANG Yueying2, HOU Linlin2, TAN Yiqing2, ZHU Lixin2,DENG Xuemei2, ZENG Dali2, ZHANG Guangheng2, GUO Longbiao2, ZHU Li2, CHEN Guang2, REN Deyong2, RAO Yuchun1, XUE Dawei3, QIAN Qian1, 2, *, HU Jiang2, *

(College of Chemistry and Life Science,,,;,,, China; College of Life and Environmental Sciences,,,;These authors contributed equally to this work;Corresponding authors,:)

【Objective】Leaf is a vital component of ideal plant type in rice. Screening and identification of new leaf mutants can lay the foundation for studying leaf development and constructing ideal leaf morphology. 【Method】A novel rice mutant named() was identified from an EMS mutagenized population of Wuyunjing 31. The leaf length, leaf width, numbers of large and small veins from flag leaf to the 4th leaf from the top were measured, and the histological section and microscopic observation were conducted at the maturity stage. The F2segregating population was constructed from a cross betweenandvariety TN1, and 1709 narrow-leaf individuals were selected for fine mapping ofwith existing SSR, STS and developed molecular markers. 【Result】Theshowed narrow leaves at seedling stage, and exhibited dwarf, increased tillers and thinner stems at maturity stage. According to the anatomy observation of tissue sections, the narrow leaf phenotype ofwas caused by the decrease in the number of large veins and small veins compared with the wild type. Genetic analysis indicated that the narrow leaf trait was regulated by a single recessive nuclear gene, andwas finally mapped to a range of 64.7 kb between LC2-RF37 and LC4R-RF39 markers on chromosome 10. A total of 10 ORFs (open reading frames) were found and there were no narrow-leaf related genes reported in this region. qRT-PCR analysis revealed that the mutation ofwas involved in the expression level of auxin synthesis and transport-related genes. 【Conclusion】is a new leaf-shape regulatory gene, which lay a foundation for further research on rice leaf development and enrich its molecular regulatory network.

rice; narrow leaf;; gene mapping

Q343.5; S511.032

A

1001-7216(2019)03-0219-08

10.16819/j.1001-7216.2019.8125

2018-11-20;

2018-12-18。

國家自然科學(xué)基金資助項目(31671666; 31871594; 91335105)；浙江省自然科學(xué)基金杰出青年項目(LR19C130001)。