周志強(qiáng)，樓海軍*

華寶香精股份有限公司上海分公司（上海 201821）

荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes（Fr.）Singer），傘菌目、白蘑科、離褶傘屬菌類植物，其分布在江蘇、廣西、青海、云南、甘肅、西藏、新疆等地區(qū)，可食用，味道鮮美，屬優(yōu)良食用菌。荷葉離褶傘菌絲體具有一定的富硒能力，在富硒的發(fā)酵過程中，硒的加入可有效提高菌絲體的干質(zhì)量[1-3]。

細(xì)胞中的氧自由基被認(rèn)為是導(dǎo)致多種疾病的原因，如癌變、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等?？寡趸瘎┌ǘ喾雍投嗵牵苡行宄杂苫m當(dāng)保護(hù)機(jī)體，防止生物氧化損傷和老化。荷葉離褶傘菌絲體中的多糖已被證明是一種有效的抗氧化劑[4-5]。

硒（Se）是一種人體必需的微量元素，是一種活躍的微量元素。硒元素通過多種硒依賴性的酶和具有抗氧化功能的硒蛋白參與動(dòng)物、人體生理活動(dòng)[6-8]。人們普遍認(rèn)為有機(jī)硒化合物毒性較低，與無機(jī)硒相比，其生物利用度和生物功能均較高。富硒食物，例如富硒酵母、富硒茶及富硒顆粒，一般都是適宜食用的。硒化荷葉離褶傘菌絲體作為硒膳食補(bǔ)充劑的主要來源。利用硒技術(shù)進(jìn)行微生物發(fā)酵，為生產(chǎn)有機(jī)硒化合物提供了一種可行、經(jīng)濟(jì)的途徑。荷葉離褶傘菌絲體已被證明能有效地從培養(yǎng)基中吸收微量元素，因此荷葉離褶傘菌絲體是硒積累、吸收的最佳選擇之一[9]。

試驗(yàn)旨在研究硒化荷葉離褶傘菌絲體的主要化學(xué)特性和抗氧化活性。此外，還研究了硒化荷葉離褶傘菌絲體對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞毒性是否有保護(hù)作用。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌絲體原料

荷葉離褶傘菌絲體，湖北省武漢華中食用菌栽培研究所。

1.1.2 試劑

硒粉（化學(xué)純CP），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒽酮（分析純），上海中泰化學(xué)試劑有限公司；3, 3’-二氨基聯(lián)苯胺（化學(xué)純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇、氯仿、正丁醇、葡萄糖、濃H2SO4、濃HCl、濃HNO3、甲苯、NaOH、EDTA-Na2，均為分析純，水為超純水。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

V-1200型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；SW-CJ 1 BU型超凈工作臺(tái)，蘇州新區(qū)楓橋凈化設(shè)備廠；BXM型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HZQ-A型恒溫培養(yǎng)振動(dòng)器（搖床），常州冠軍儀器制造有限公司；FA 1104型電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；IEC Multi型高速離心機(jī)，美國(guó)熱電集團(tuán)；RE 52 AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取純化

將脫水干燥的荷葉離褶傘菌絲體與蒸餾水混合，并在90 ℃的水中攪拌2 h，然后收集上清液并濃縮，加入4倍體積的乙醇并保持在4 ℃的溫度中放置12 h。通過4 000 r/min進(jìn)行離心10 min后，獲得硒化荷葉離褶傘菌絲體沉淀，并用試劑讓其脫蛋白，用水透析后，將粗制硒化荷葉離褶傘菌絲體施加到DEAE-52 Sepharose Fast Flow離子柱（2.6 cm×40 cm）和Sephadex G-100（30 cm×2.6 cm）離子柱層析，收集一個(gè)主要部分硒化荷葉離褶傘菌絲體并凍干供進(jìn)一步研究。

1.2.2 分子量分布測(cè)定

硒化荷葉離褶傘菌絲體的平均分子量通過配備有凝膠色譜柱TSK-GEL G 4000 PWXL（7.8 mm×300 mm，柱溫30 ℃）和HPGPC法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 FT-IR和NMR分析

將1 mg硒化荷葉離褶傘菌絲體與150 mg干燥溴化鉀粉末研磨并壓制成顆粒，在傅里葉變換紅外分光光度計(jì)上進(jìn)行吸光度模式的分析，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

將樣品溶解在D2O中，交換3次，然后凍干并重新溶解在D2O中，用分光計(jì)（600 MHz）在298 K溫度下記錄1H NMR和13C NMR圖譜。

1.2.4 單糖組成分析

樣品用三氟乙酸溶解并在110 ℃的油浴中水解5 h，然后在90 ℃下乙?；? h，將乙?；臉悠啡芙庠诙燃淄橹校糜谶M(jìn)一步GC分析。

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]并做修改測(cè)定硒化荷葉離褶傘菌絲體的DPPH自由基清除能力及羥自由基清除活性。

DPPH自由基（DPPH·）清除能力測(cè)定：用60%乙醇水溶液分別配制不同濃度的維生素C及硒化荷葉離褶傘菌絲體溶液。取0.2 mL維生素C及硒化荷葉離褶傘菌絲體溶液，分別加入至1.8 mL的DPPH乙醇溶液中（濃度為1×10-4mol/L），迅速混勻反應(yīng)20～30 min，然后再以分光光度計(jì)在710 nm下測(cè)定各吸光度。DPPH的清除率按是（1）計(jì)算。

式中：D0為未加樣的DPPH乙醇溶液的吸光度；K為樣品與DPPH反應(yīng)后的吸光度；K0為樣品的空白（0.2 mL+1.8 mL 60%乙醇水溶液）的吸光度。結(jié)果以三次的平均值表示。

羥自由基（·OH）清除能力的測(cè)定：以VC作陽(yáng)性對(duì)照，分別測(cè)定VC及硒化荷葉離褶傘菌絲體的清除羥自由基能力。取5 mL不同濃度VC及硒化荷葉離褶傘菌絲體溶液加入試管中，分別依次加入10 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、5 mL 9.0 mmol/L的水楊酸溶液和10 mL 0.3% H2O2溶液，迅速混勻反應(yīng)20～30 min，然后再以分光光度計(jì)在510 nm下測(cè)定各吸光度。硒化荷葉離褶傘菌絲體清除率按式（2）計(jì)算。

式中：K0為空白組的吸光度（純水代替樣品）；K1為硒化荷葉離褶傘菌絲體樣品的吸光度；K2為硒化荷葉離褶傘菌絲體樣品干擾試驗(yàn)的吸光度（水楊酸溶液代替FeSO4溶液和H2O2溶液）。

1.2.6 硒化荷葉離褶傘菌絲體對(duì)雙氧水損傷PC-12細(xì)胞的保護(hù)作用

將PC-12細(xì)胞以1×105mL-1的密度接種在6孔板或細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。在暴露于濃度為400 pmol/L雙氧水之前，將細(xì)胞分別用400 pg/mL硒化荷葉離褶傘菌絲體和200 pg/mL的VC預(yù)處理24 h，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，在熒光顯微鏡上觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有計(jì)算均采用IBM SPSS 22.0軟件處理，結(jié)果以平均±SD（標(biāo)準(zhǔn)差）表示。以方差分析方法確定差異；使用方差分析來確定樣本結(jié)果之間的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 硒化荷葉離褶傘菌絲體化學(xué)成分和單糖成分

通過熱水浸提法、80%乙醇沉淀和Sevag試劑脫蛋白，從荷葉離褶傘菌絲體的子實(shí)體中得到的硒化荷葉離褶傘菌絲體產(chǎn)量為5.37%，然后用DEAE-52 Sepharose Fast flow層析柱和Sephadex G-100純化。收集一個(gè)部分，命名為Se-POP-11，獲得相對(duì)高的硒化荷葉離褶傘菌絲體含量（53.68%），產(chǎn)率為1.27%。Se-POP-11總碳水化合物、蛋白質(zhì)、糖醛酸、硫酸鹽和硒含量分別為85.26%，7.41%，1.89%，4.32%和3.21 pg/g。硒含量高于天然荷葉離褶傘菌絲體多糖，與富硒紫陽(yáng)綠茶（2.14 pg/g）和硒化荷葉離褶傘菌絲體（Se-GP 33，4.50 pg/g）的硒含量相近[11-13]。

2.2 硒化荷葉離褶傘菌絲體結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果及分析

紅外光譜通常用于鑒定硒化荷葉離褶傘菌絲體中的特征性的有機(jī)基團(tuán)，Se-POP-11的紅外吸收度如圖1所示，3 339 cm-1處的吸光度帶由羥基伸展而產(chǎn)生，而在1 048 cm-1處有一個(gè)（COH）側(cè)鏈基團(tuán)，木聚糖譜2 933 cm-1處的峰表示C—H振動(dòng)，在1 606 cm-1歸因于N—H拉伸，這表明蛋白質(zhì)存在于硒化荷葉離褶傘菌絲體中。紅外光譜中1 408和1 161 cm-1處的兩個(gè)伸縮峰表明存在C—O鍵，在1 408.79 cm-1處的信號(hào)表明沒有羧酸根陰離子基團(tuán)（C==O）的對(duì)稱伸縮，1 078.36 cm-1被指定為吡喃糖形式的糖。這些共同的峰表明，根據(jù)其他結(jié)果，硒的引入不影響硒化荷葉離褶傘菌絲體的主要結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)在794 cm-1處觀察到的一個(gè)驚人的峰，在由根瘤菌合成的含硒胞外硒化荷葉離褶傘菌絲體中發(fā)生Se==O伸縮振動(dòng)。觀察到的802 cm-1也可能表明Se==O存在。

核磁共振分析涉及1H NMR和13C NMR試驗(yàn)，圖2用于指定重復(fù)單元中糖殘基的化學(xué)位移。對(duì)于δ 5.203處的所有殘基H-1質(zhì)子的化學(xué)位移高于4.9 mg/L，這證實(shí)了端點(diǎn)結(jié)構(gòu)與（1→4）-α-D Glcp相關(guān)。3.2～4.1 mg/L出現(xiàn)的化學(xué)位移被分配給原H-2至H-6的NS信號(hào)。在3.6～3.9 mg/L處的強(qiáng)信號(hào)也與β-吡喃半乳糖鍵的存在一致。此外在60～80 mg/L范圍內(nèi)的13C NMR譜顯示C-2至C-6的碳水化合物碳信號(hào)，另外，在80～90 mg/L范圍內(nèi)沒有碳信號(hào)，說明Se-PO-11不是呋喃糖。根據(jù)文獻(xiàn)及現(xiàn)有的數(shù)據(jù)，13C NMR中98～109 mg/L區(qū)域的共振歸因于硒化荷葉離褶傘菌絲體的異頭碳原子[9-10,14]。

圖2 Se-POP-11在重水中1H NMR譜（1）和13C NMR譜（2）

2.3 硒化荷葉離褶傘菌絲體生物活性測(cè)定結(jié)果及分析

圖3 SE-POP-11（1）和HPGPC標(biāo)準(zhǔn)曲線（2）圖

通過使用已知分子量的各種葡聚糖T系列標(biāo)準(zhǔn)物（log MW=8.641 4-0.380 6t，R2=0.994 5，MW為分子量，t為保留時(shí)間（min））獲得校準(zhǔn)曲線。HPGPC曲線（圖3）表明Se-POP-11具有單一的窄的對(duì)稱峰，這表明Se-POP-11是均勻的硒化荷葉離褶傘菌絲體，平均分子量約為9.43 kDa，Se-EPS分子量為7.3 kDa，這兩個(gè)結(jié)果表明硒化荷葉離褶傘菌絲體的分子量在生物法硒化后降低。

如圖4所示，Se-POP-11的羥自由基清除活性及DPPH的清除作用在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，其對(duì)羥自由基清除活性最高清除率可達(dá)94.62%。

Se-POP-11對(duì)ABTS自由基的清除能力結(jié)果如圖4所示。Se-POP-11對(duì)ABTS自由基的清除活性具有濃度依賴性，在6 mg/mL時(shí)分別為96.45%和99.56%。

圖4顯示了樣品對(duì)超氧自由基的清除能力，Se-POP-11和VC對(duì)超氧陰離子自由基的抑制能力與其濃度直接相關(guān)。當(dāng)質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，Se-POP-11和VC的清除活性分別為97.49%和99.84%。據(jù)報(bào)道，富含硒的多糖具有較強(qiáng)的超氧自由基清除活性，其作用機(jī)理可能是硒化荷葉離褶傘菌絲體的三維結(jié)構(gòu)被硒基（SeH）或硒酸酯所改變，這會(huì)影響氫原子的供體能力和抗氧化能力。否則，硒本身具有更強(qiáng)的抗氧化活性。

化合物的還原能力可作為潛在抗氧化活性的重要指標(biāo)[5-6]。圖4顯示，Se-POP-11和VC的還原潛力通常隨著其在試驗(yàn)劑量中濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)Se-POP-11質(zhì)量濃度達(dá)到6 mg/mL時(shí)，Se-POP-11和VC的質(zhì)量濃度分別為1.772和2.59 mg/mL，硒化荷葉離褶傘菌絲體對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化有保護(hù)作用。

圖4 不同質(zhì)量濃度下Se-POP-11 DPPH自由基（1）、羥自由基（2）、ABTS自由基（3）、超氧陰離子自由基（4）和還原力（5）活性圖

3 結(jié)論

綜上所述，經(jīng)DEAE-52和G-100純化得到純度較高的荷葉離褶傘菌絲體Seul-11，其硒含量為3.21 pg/g，其主要成分為葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖，其摩爾比分別為5.30︰1.55︰2.14︰0.29︰0.63，平均分子量約為9.43 kDa。硒化荷葉離褶傘菌絲體對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基、ATBS自由基和DPPH自由基均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除活性，并且對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞嚴(yán)重氧化損傷具有抑制作用。以上結(jié)果表明硒化荷葉離褶傘菌絲體在體外具有有效的抗氧化性能，可以作為功能性食品成分或有機(jī)硒補(bǔ)充劑的藥物進(jìn)行探索。對(duì)硒與硒化荷葉離褶傘菌絲體的結(jié)合形式應(yīng)進(jìn)行更詳細(xì)的研究，并在隨后的研究中進(jìn)行抗癌等生物學(xué)功能研究。