邱朝坤，范露，劉家祺

武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院（武漢 430205）

近年來(lái)，隨著新興提取技術(shù)的不斷完善和科研技術(shù)的提升，對(duì)天然活性肽的研究日漸深入[1]。天然活性肽具有顯著的生理功能，如神經(jīng)調(diào)節(jié)、激素作用、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、抗高血壓、降膽固醇、抑菌、抗病毒、抗癌、抗氧化作用等，被譽(yù)為“21世紀(jì)人類健康的新寵兒”[2-3]。肽對(duì)食品滋味有重要作用[4]，各種肽呈味肽因肽鏈長(zhǎng)度、氨基酸組成、氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)的不同而呈現(xiàn)出不同的呈味特性[5]。肽還可與食品中其他風(fēng)味物質(zhì)相互作用，明顯改變?cè)酗L(fēng)味[6]。

宣恩火腿是中國(guó)湖北省恩施自治州一帶的特產(chǎn)，尤其以宣恩縣所產(chǎn)火腿最負(fù)盛名，在清代乾隆時(shí)期就作為貢品進(jìn)貢朝廷。宣恩火腿具有肉質(zhì)細(xì)嫩、皮黃脂白肉紅、氣味鮮香宜人、滋味濃郁等特點(diǎn)[7]?；鹜戎械牡鞍踪|(zhì)在內(nèi)源酶和外源酶的作用下分解成多肽、二肽等，而二肽的感官特性跟組成氨基酸有十分密切關(guān)聯(lián)，對(duì)其味感有重要作用[8]。試驗(yàn)以宣恩火腿為研究對(duì)象，利用磷酸鹽提取火腿中的粗肽液，為后續(xù)研究宣恩火腿蛋白質(zhì)降解規(guī)律、多肽生理活性等提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

火腿（湖北省思樂(lè)牧業(yè)集團(tuán)有限公司）。

所用試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

MS 104 S型分析天平（瑞士梅特勒）；LR-（5-10）型均質(zhì)機(jī)（無(wú)錫意凱自動(dòng)化技術(shù)有限公司）；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)（天津市普瑞斯儀器有限公司）；TDL-5 A型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

剔除不可食用的火腿表面氧化層（約5 mm），油頭（指火腿最下方部分約3 cm）以及肥膘部分，取火腿塊約500 g，切碎，用絞肉機(jī)攪碎后攪拌均勻，裝入密封袋中備用，4 ℃存放

1.3.2 粗肽液提取

樣品多肽提取方法參照胡亞亞等[9]的方法進(jìn)行，具體試驗(yàn)步驟為：稱取25 g樣品于均質(zhì)機(jī)中，加入100 mL pH 7.0磷酸鹽緩沖液（4 ℃）勻漿2 min，勻漿液于4 ℃，以12 000 r/min離心20 min，取上清液加入3倍體積40%乙醇，4 ℃放置12 h后再次離心（4 ℃，12 000 r/min，20 min），所得上清液用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH 7.0，即得宣恩火腿粗肽液。

1.3.3 粗肽液測(cè)定

肽含量測(cè)定方法參照方細(xì)娟的方法進(jìn)行[10]，具體試驗(yàn)步驟為：準(zhǔn)確吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 2.5 mg/mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中，用水補(bǔ)齊至1.0 mL，加入5.0 mL福林酚試劑，立即混勻，室溫下放置30 min，在650 nm處比色測(cè)定吸光度。以牛血清蛋白質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1 mL宣恩火腿粗肽液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定步驟測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品多肽含量。

1.3.4 樣品質(zhì)量（g）與緩沖液體積（mL）比單因素試驗(yàn)

控制乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，勻漿液與乙醇體積比1︰3，緩沖液pH 7條件下，分別研究樣品質(zhì)量與緩沖液體積比為15︰100，20︰100，25︰100，30︰100和

35 ︰100 g/mL時(shí)，宣恩火腿中粗肽含量。

1.3.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素試驗(yàn)

控制樣品質(zhì)量與緩沖液體積比25︰100 g/mL，勻漿液與乙醇體積比1︰3，緩沖液pH 7條件下，分別研究乙醇體積分?jǐn)?shù)20%，30%，40%，50%和60%時(shí)，宣恩火腿中粗肽含量。

1.3.6 緩沖液pH單因素試驗(yàn)

控制乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，勻漿液與乙醇體積比1︰3，樣品質(zhì)量與緩沖液體積比25︰100 g/mL條件下，分別研究緩沖液pH為5，6，7，8和9時(shí)，宣恩火腿中粗肽含量。

1.3.7 勻漿液體積與乙醇體積比單因素試驗(yàn)

控制乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，樣品質(zhì)量與緩沖液體積比為25︰100 g/mL，緩沖液pH 7條件下，分別研究勻漿液體積與乙醇體積比為1︰1，1︰2，1︰3，1︰4和1︰5時(shí)，宣恩火腿中粗肽含量。

1.3.8 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇樣品質(zhì)量與緩沖液體積比、緩沖液pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)、勻漿液與乙醇體積比4個(gè)因素，以宣恩火腿中粗肽含量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品質(zhì)量與緩沖液體積比單因素試驗(yàn)結(jié)果

宣恩火腿中的肽主要來(lái)源于蛋白質(zhì)的降解，大部分屬于水溶性或能用低濃度鹽溶液溶解，采用緩沖鹽提取火腿中的肽，緩沖液體積對(duì)提取效果具有重要影響，體積過(guò)少，肉基質(zhì)無(wú)法分散，肽提取不充分，體積過(guò)大，樣品均質(zhì)勻漿效果可能變差導(dǎo)致提取到的肽反而變少。從圖1可以看出，樣品中多肽含量隨著溶劑用量的增大呈先上升后下降趨勢(shì)，樣品質(zhì)量與緩沖液體積比20︰100 g/mL時(shí)提取到的多肽含量最高，為2.35 g/100 g，因而選取15︰100，20︰100和25︰100 g/mL這3個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素試驗(yàn)結(jié)果

粗肽提取液仍然以蛋白質(zhì)為主體物質(zhì)，因此采用乙醇來(lái)沉淀蛋白并離心去除，故而選擇恰當(dāng)?shù)囊掖俭w積分?jǐn)?shù)顯得尤為重要，乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)低，達(dá)不到沉淀蛋白的效果，乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，蛋白質(zhì)和多肽溶解度都會(huì)下降。從圖2可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，提取的多肽含量逐漸下降，但乙醇體積分?jǐn)?shù)20%時(shí)，多肽含量達(dá)2.94 g/100 g，明顯高于其他水平（包括高于其他單因素試驗(yàn)里多肽含量），可能是蛋白質(zhì)沒(méi)有沉淀完全，而福林酚試劑也會(huì)與之反應(yīng)，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高。綜合考慮，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，40%和50%進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖1 樣品質(zhì)量與緩沖液體積比對(duì)粗肽液提取效果的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)粗肽液提取效果的影響

2.3 緩沖液pH單因素試驗(yàn)結(jié)果

由于受多肽骨架在中氨基酸側(cè)鏈的影響，多肽溶解性與提取液pH有較大關(guān)聯(lián)度，忽曉平等[11]對(duì)金華火腿多肽的提取研究結(jié)果表明，采用磷酸鹽緩沖液做提取劑時(shí)，強(qiáng)酸性環(huán)境、中性偏堿性環(huán)境有利于金華火腿中多肽的提取。磷酸鹽緩沖液的pH 2或pH 7.0～9.0時(shí)，提取率較高。從圖3可以看出，宣恩火腿多肽在中性偏堿條件下溶解度更高，因而選擇緩沖液pH 7.0，8.0和9.0進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.4 勻漿液體積與乙醇體積比單因素試驗(yàn)結(jié)果

乙醇體積對(duì)提取效果的影響與乙醇體積分?jǐn)?shù)相對(duì)應(yīng)，從圖4可以看出，勻漿液與乙醇體積比1︰3時(shí)能夠提取到的多肽含量最大，綜合考慮，選擇勻漿液體積與乙醇體積比1︰1，1︰2和1︰3進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖3 緩沖液pH對(duì)粗肽液提取效果的影響

圖4 勻漿液體積與乙醇體積比對(duì)粗肽液提取效果的影響

2.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行極差分析，得出宣恩火腿中粗肽液提取的最佳工藝條件為A1B2C1D3，即樣品質(zhì)量與緩沖液體積比15︰100 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，緩沖液pH 7.0，勻漿液與乙醇體積比1︰3。4個(gè)因素對(duì)宣恩火腿中粗肽液的提取效果影響性存在差別，其重要性依次為C＞B＞A＞D，即緩沖液pH＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞樣品質(zhì)量與緩沖液體積比＞勻漿液體積與乙醇體積比，因此在對(duì)宣恩火腿中的粗肽液的提取時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控制緩沖液pH以保證宣恩火腿中粗肽液較高的提取率。

由于A1B2C1D3在正交表中并未出現(xiàn)，正交表中最高組合為A3B2C1D3，因而在上述2組組合中進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，2種條件下提取的粗肽含量差異不大，2種條件下差別僅在緩沖液用量，而在單因素試驗(yàn)中當(dāng)。樣品質(zhì)量與緩沖液體積比15︰100和25︰100 g/mL時(shí)提取的粗肽含量也比較接近，從節(jié)約試劑角度考慮，選取樣品質(zhì)量與緩沖液體積比15︰100 g/mL。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)

3 結(jié)論

以中國(guó)四大名腿之一的宣恩火腿為對(duì)象，研究其多肽的提取條件，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)影響宣恩火腿中粗肽液提取效果的樣品質(zhì)量與緩沖液體積比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、緩沖液pH、勻漿液與乙醇體積比進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，宣恩火腿多肽最佳提取條件為：樣品質(zhì)量與緩沖液體積比15︰100 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，緩沖液pH 7.0，勻漿液與乙醇體積比1︰3。在此條件下能最大限度提取出宣恩火腿中的多肽，為后續(xù)研究宣恩火腿蛋白質(zhì)降解規(guī)律、多肽生理活性等提供參考。