張赟彬 ，許靜，魏蒙月*，毛彥佳，萬文娟

1. 上海中醫(yī)藥大學公共健康學院（上海 201203）；2. 上海應用技術大學香料香精技術與工程學院（上海 200234）；3. 上海中僑職業(yè)技術學院食品學院（上海 201319）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種導致癡呆、認知功能障礙和記憶力受損的漸進性神經退行性疾病[1]。AD病不僅嚴重影響患者的健康和生活品質，還給家庭和社會帶來相當大的負擔。根據已有研究顯示，AD的神經性損傷部分歸因于膽堿能的干擾，而乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinnesterase enzyme，AchE）抑制劑對乙酰膽堿酯酶起到明顯抑制作用，從而控制乙酰膽堿的水平達到AD病的治療目的[2-4]。目前從天然產物中提取乙酰膽堿酯酶抑制劑已成為開發(fā)新型AD藥物的研究熱點[5-6]。

從香辛料中提取乙酰膽堿酯酶抑制劑是重要的研究方向之一。Cuong等[7]研究發(fā)現八角茴香分離物中的萜類等化合物在體外乙酰膽堿酯酶抑制活性測試中表現出明顯的抑制作用；Ingkaninan等[8]研究發(fā)現甲醇提取的胡椒提取物具有抗乙酰膽堿的抑制活性；而有研究發(fā)現胡椒中的胡椒堿可抑制乙酰膽堿從而防止神經受損[9]。我國香辛料資源豐富。小茴香（學名：Foeniculum vulgare L.）是我國人民常用的香辛料，是傘形科的多年生草本植物[10]，在我國廣西、內蒙等地區(qū)均有廣泛的種植。目前對小茴香中乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究還鮮見報道。試驗以廣西小茴香為原料，通過單因素試驗結合正交試驗對提取工藝條件進行優(yōu)化，為實現小茴香中乙酰膽堿酯酶的高效提取打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小茴香（產地廣西），市售；乙酰膽堿酯酶（500 U/2 mg）、硫代乙酰膽堿、二硫二硝基苯甲酸、十二烷基硫酸鈉，美國Sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鎂、乙醇、甲醇、石油醚，均為分析純，上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

ME 204 E電子天平，托利多儀器上海有限公司；DK-S 24恒溫數顯水浴鍋，常州翔天實驗儀器廠；EMS-20磁力攪拌油浴鍋，喬躍電子上海有限公司；KQ-50 DE超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1800紫外可見光光度計，島津中國有限公司；BUCHI R-2真空旋轉蒸發(fā)儀，Buchi實驗室設備貿易上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AchE抑制活性測定方法

采用改進的Ellman’s方法[11]。在樣品測試組中，試管中依次加入2 900 μL pH 8.0的PBS緩沖溶液、20 μL 1.0 U/mL AchE和100 μL 1.0 mg/mL的小茴香提取液，振蕩混勻后將試管置于37 ℃水浴鍋預熱2 min，然后將50 μL 15 mmol/L DTNB溶液和50 μL 15 mmol/L ATch溶液依次加入試管中，振蕩混勻，在37 ℃下水浴20 min，最后加入1.0 mL 4% SDS以停止反應，在波長412 nm處快速測定吸光度。在測定中，對照組使用100 μL 10%乙醇溶液代替10 μL 1.0 mg/mL的樣品提取液，記作A對照。在空白組中，使用100 μL的PBS緩沖液代替100 μL小茴香提取液，記作A空白。在樣品本底組，用20 μL的PBS緩沖液代替20 μL的0.1 U/mL AchE，記作A本底。按式（1）計算抑制率。

1.3.2 小茴香AchE抑制劑提取單因素試驗

1.3.2.1 小茴香不同溶劑提取液的制備

采用回流法提取小茴香中乙酰膽堿酯酶抑制劑。稱取10 g小茴香粉末加入120 mL不同溶劑（乙醇、甲醇、石油醚、蒸餾水）中，提取溫度70 ℃、回流提取時間100 min，抽濾，旋轉蒸發(fā)（90 mbar，45 ℃，20 r/min）后提取液用10%乙醇稀釋至1.0 mg/mL，備用。

1.3.2.2 小茴香不同乙醇體積分數提取液的制備

采用不同乙醇體積分數（60%，70%，80%，90%和100%）提取小茴香中乙酰膽堿酯酶抑制劑，其余同1.3.2.1小節(jié)，制得提取液。

1.3.2.3 小茴香不同提取時間提取液的制備

稱取10 g小茴香粉末加入120 mL 75%乙醇溶液中，提取溫度70 ℃、回流提取時間分別為60，90，120，150和180 min，其余同1.3.2.1小節(jié)，制得提取液。

1.3.2.4 小茴香不同溫度提取液的制備

采用不同提取溫度（55，65，75，85和95 ℃）提取小茴香中乙酰膽堿酯酶抑制劑，提取時間120 min，其余同1.3.2.3小節(jié)，制得提取液。

1.3.2.5 小茴香不同料液比提取液的制備

在不同體積（90，120，150，180和210 mL）含75%乙醇的溶液中加入10 g小茴香粉末，得到不同料液比（1︰9，1︰12，1︰15，1︰18和1︰21 g/mL）的提取液，采用提取溫度50 ℃、回流提取時間120 min回流提取條件，其余同1.3.2.3小節(jié)，制得提取液。

1.3.3 小茴香AchE抑制劑提取正交試驗

依據單因素試驗結果，選取料液比、提取時間、提取溫度和乙醇體積分數四個影響較大的單因素及相應水平設計L9(43)正交試驗進行工藝優(yōu)化，因素與水平見表1。以小茴香提取液中AchE抑制率為指標，優(yōu)化出小茴香中乙酰膽堿酯酶抑制劑提取的最佳工藝條件。

表1 正交試驗因素與水平

以正交試驗所確定的最佳工藝條件對小茴香進行乙酰膽堿酯酶抑制劑的提取，驗證比較AchE抑制率。

2 結果與分析

2.1 小茴香乙酰膽堿酯酶提取工藝的單因素試驗

2.1.1 不同溶劑的小茴香提取液對AchE抑制率的影響

由圖1可知，在利用不同溶劑提取小茴香中乙酰膽堿酯酶抑制劑的試驗過程中，當以乙醇作為提取溶劑時小茴香提取液中AchE抑制活性成分含量最高，抑制率效果最好，其次為以水作為提取溶劑，可見小茴香中AchE抑制活性成分易溶于乙醇和水中。因此，在后續(xù)試驗中測定不同體積分數的乙醇水溶液對提取小茴香中AchE抑制劑的影響。

圖1 不同溶劑的小茴香提取液對AchE抑制率的影響

2.1.2 不同乙醇體積分數的小茴香提取液對AchE抑制率的影響

由圖2可知，小茴香提取液中AchE抑制率隨乙醇體積分數的增加而增加，并且在乙醇體積分數為75%時達到了最大AchE抑制率水平，隨乙醇體積分數的進一步升高卻呈下降趨勢。表明小茴香中含有的抑制AchE的活性成分物質有部分易溶于水中，有部分易溶于乙醇，當乙醇體積分數為75%時，兩者的總提取量達到最大。因此，在后續(xù)試驗中選定提取溶劑為75%乙醇溶液。

圖2 不同乙醇體積分數的小茴香提取液對AchE抑制率的影響

2.1.3 不同浸提時間的小茴香提取液對AchE抑制率的影響

由圖3可知，隨著浸提時間的延長，小茴香提取液中AchE抑制率隨提取時間的增加而增加，當提取時間為120 min時，抑制效率最高，抑制效果最好；而加熱回流時間繼續(xù)延長，抑制率反而下降，可能是由于加熱促進有效成分的溶出，但加熱時間太久也可能導致小茴香提取液中抑制AchE類有效成分部分失活?？紤]實際過程中提取效率和節(jié)約能源，最終確定后續(xù)試驗中浸提時間為120 min。

2.1.4 不同提取溫度的小茴香提取液對AchE抑制率的影響

由圖4可知，隨著溫度的升高，小茴香提取液對AchE抑制率不斷提升，在75 ℃時抑制率為最大，繼續(xù)升高溫度使得AchE抑制率反而下降。原因可能是小茴香提取液中AchE抑制劑類化合物的溶解度隨溫度的升高而釋放和溶解，在75 ℃時溶出最多，但過高溫度也會導致小茴香提取液中某些抑制劑活性成分化合物的降解。因此，后續(xù)試驗選定浸提溫度為75 ℃。

圖3 不同浸提時間的小茴香提取液對AchE抑制率的影響

圖4 不同提取溫度的小茴香提取液對AchE抑制率的影響

2.1.5 不同料液比的小茴香提取液對AchE抑制率的影響

由圖5可知，提取溶劑的體積從90 mL增加到120 mL后，提取率有明顯上升，但溶劑量的進一步增加對小茴香提取液中AchE抑制劑的提取沒有提升反而下降?？紤]到AchE提取效率和生產成本，最終確定后續(xù)試驗中料液比為1︰12 g/mL。

2.2 小茴香乙酰膽堿酯酶抑制劑提取工藝的正交試驗優(yōu)化結果

在單因素試驗基礎上獲得了各工藝條件最佳參數，以AchE抑制率為指標，對影響抑制率最重要的4個因素進行L9(34)正交試驗，試驗設計及結果見表2。

由表2可知，各因素對小茴香中AchE抑制劑的提取影響效果順序為C＞D＞B＞A，提取溫度對小茴香中AchE抑制劑的提取效果影響最大，第二因素是提取時間、乙醇體積分數，采用合適的乙醇體積分數提取會使小茴香提取液中AchE抑制率上升。浸提時間對提取的有效成分影響效果較弱，料液比對小茴香中AchE抑制劑的提取基本無明顯影響。綜上所述，小茴香中AchE抑制劑提取的最佳條件為A1B3C2D3，即浸提溫度為75 ℃，乙醇體積分數為85%，浸提時間為150 min，小茴香與溶劑體積比為1︰12 g/mL，AchE抑制劑的提取效率最優(yōu)。

圖5 不同料液比的小茴香提取液對AchE抑制率的影響

表2 小茴香AchE抑制劑提取正交試驗設計及結果

2.3 驗證試驗

由表2可知，在正交試驗最優(yōu)化提取方案中小茴香中AchE抑制劑提取最優(yōu)組合為A1B3C2D3，而單因素試驗中小茴香中AchE抑制劑提取最優(yōu)組合為A3B1C2D3，對兩種工藝條件進行試驗，結果如表3所示?？紤]到節(jié)約成本、低耗能高提取效果的原則，綜合確定最優(yōu)提取方案為A1B3C2D3，得到小茴香提取液中乙酰膽堿酯酶抑制率為57.543%。

3 結論

通過正交試驗設計及驗證試驗，確定出小茴香中乙酰膽堿酯酶抑制劑提取的最佳工藝：85%的乙醇作為提取溶劑，料液比1︰12 g/mL，在提取溫度為75 ℃下回流提取150 min。在最佳工藝條件下小茴香提取液中乙酰膽堿酯酶抑制率達到57.543%。

試驗建立了回流提取法制備高AchE抑制活性的小茴香提取物的最佳提取工藝，為實現小茴香中乙酰膽堿酯酶的高效提取打下基礎。