李金珂,王玉娜,李麗麗,馬雪征,張麗萍,趙 欣,程 銘,周春雅,王 濤,胡孔新*

(1.天津大學生命科學學院,中國天津300072;2.中國檢驗檢疫科學研究院衛(wèi)生檢疫研究所,中國北京100176;3.哈爾濱醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院,中國黑龍江哈爾濱150001;4.湖北國際旅行衛(wèi)生保健中心,中國湖北武漢430000;5.杭州蕭山機場海關,中國浙江杭州310000)

生物氣溶膠(bioaerosol)指的是含有生物活性成分的氣溶膠粒子,往往包含細菌、真菌、病毒等微生物粒子和孢子、植物花粉、動物碎片等生物體所釋放的微粒成分[1～2],生物粒子大小在 0.01～100 μm之間。雖然生物粒子在空氣顆粒物中所占比例不大,但其長時間懸浮在空氣中,對人體健康的潛在危害不容小視[3]。近些年生物氣溶膠的潛在危害性被越來越多的人重視,2017年6月,以“生物氣溶膠與人類健康、國家生物安全及大氣污染”為主題的學術討論會在北京成功召開[4]。

分子生物學方法是空氣生物學研究的重要手段。管家基因是指為細胞的生存提供基本功能,因而在所有細胞中都表達的基因,常常作為內參基因應用于分子生物學研究中[5]。本研究根據細菌、動物和植物3種生物氣溶膠組成成分的管家基因,分別設計特異引物探針,利用熒光定量PCR方法實現對不同生物氣溶膠組分的相對定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

病毒氣溶膠采集富集儀BIO Capturer-6由中國檢驗檢疫科學研究院衛(wèi)生檢疫研究所自主研發(fā),杭州富集生物科技公司生產。文中所用PCR儀為美國ABI公司生產的7500 Fast實時熒光定量PCR儀。

1.1.2 試劑

磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01 mol/L,pH 7.2～7.4)購自Biosharp公司;磁珠富集液為課題組自制;動物組織、細菌樣本的核酸提取試劑盒為德國QIAGEN公司的Blood&Tissue Kit;植物組織樣本的提取試劑盒為北京天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒;環(huán)境樣本的核酸提取試劑盒為德國QIAGEN公司的DNeasy PowerWater Kit;實時熒光定量PCR擴增試劑盒One-Step RT-PCR Kit購自賽默飛世爾科技有限公司。本研究所用引物探針均由上海英濰捷基貿易有限公司合成。

1.2 管家基因引物探針序列的特異性驗證

1.2.1 樣本來源

該部分分別利用動植物組織和細菌樣本對各自管家基因的引物探針進行驗證。動物組織選用的豬肉、牛肉、魚肉和雞肉樣本,以及植物樣本油菜、萵苣均購自北京大興區(qū)舊宮鎮(zhèn)萬科廣場永輝生活超市。冬青樣本采集于北京市大興區(qū)舊宮鎮(zhèn)舊忠路街道,杜仲、紫葉桃、銀杏、滴水觀音、綠蘿樣本采集于中國檢驗檢疫科學研究院院內。所用細菌樣本為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、糞鏈球菌,均屬于實驗室保存菌種。

1.2.2 擴增方法

細菌擴增管家基因選擇16S rRNA[6],具體引物探針見表1。動物擴增管家基因選擇動物線粒體16S rRNA[7]。植物擴增管家基因選擇植物內源性基因tRNA-leu[8],并根據20余種常見植物tRNA-leu序列(序列信息見表2),使用MEGA 7進行多序列比對后自行設計得出最優(yōu)探針序列(表1)。

擴增反應體系為25 μL,擴增程序如下:95℃,9 min;95℃,15 s,60℃,60 s(40個循環(huán))。擴增實驗對照組使用其余兩類生物核酸(比如:若驗證細菌引物則對照組為動物、植物核酸樣本),陰性對照使用熒光定量PCR擴增試劑盒內提供的無菌無核酸酶水。

1.3 室外環(huán)境生物氣溶膠樣本分析

1.3.1 環(huán)境氣溶膠樣本的采集

本研究使用BIO Capturer-6病毒氣溶膠采集富集儀共采集環(huán)境氣溶膠樣本28份。采集地為中國檢驗檢疫科學研究院院內(北緯 39°47′0′′,東經 116°30′37′′),采樣點選取中國檢驗檢疫科學研究院主樓12層頂開放性天臺(距地平面高度60 m)和后院內地平面,時間為2018年6月27日至7月3日共7 d,每天分上午和下午兩個時段進行采樣。采樣時記錄溫濕度等天氣狀況,7 d內采樣溫度跨度為24～39℃,相對濕度跨度為15%～82%。

采集氣溶膠樣本時,采樣瓶中加入采樣液PBS 50 mL,并加入150 μL磁珠。每個空氣樣本設定采樣量為1 000 L。采樣完成后將采樣瓶放到磁力架上,靜置吸附10 min,使磁珠充分被吸附于磁鐵處,倒掉上清,移走磁力架,加入500 μL PBS,使磁珠重懸,吸出至1.5 mL EP管中,放于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。采樣瓶不重復使?采樣噴頭旋下后用75%乙醇浸泡至少1 h,使用雙蒸水沖洗干凈,放入80℃烘箱中過夜干燥備用。

陰性對照樣本的采集:在實驗室選擇一臺Ⅱ級生物安全柜,打開運轉20 min后,將BIO Capturer-6采樣器放到安全柜操作臺面上,采集1 000 L無菌空氣樣本作為陰性對照。

表1 熒光定量PCR引物探針序列Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR analysis

表2 25種植物的tRNA-leu序列信息Table 2 tRNA-leu sequence information of 25 plants

1.3.2 環(huán)境氣溶膠樣本管家基因的檢測

使用DNeasy PowerWater Kit水樣DNA提取試劑盒提取樣本核酸,熒光定量PCR擴增方法同步驟1.2.2。

1.4 數據統(tǒng)計分析

采用SPSS 23.0軟件對數據進行統(tǒng)計檢驗,兩組間正態(tài)分布計量資料的均數比較采用t檢驗,多組間比較采用方差分析,計量資料組間兩兩比較采用q檢驗,相關性分析采用Spearman等級相關分析,以P＜0.05作為具有統(tǒng)計學差異的檢驗標準。

2 結果

2.1 管家基因引物探針序列的特異性驗證

2.1.1 細菌16S rRNA基因引物探針的通用性及特異性檢測

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、糞鏈球菌的DNA樣本作為實驗組,并取部分動物(豬肉、雞肉)和植物(杜仲、銀杏)的 DNA樣本作為對照組,進行熒光定量PCR檢測,結果如下:金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、糞鏈球菌樣本的 Ct值分別為 15.81、12.62、12.07、9.05;選用的杜仲、銀杏、豬肉、雞肉以及體系水對照樣本均無擴增曲線。雖然多次重復結果的陽性Ct值有細微改變,但各物種擴增結果相同。以上結果證明16S rRNA引物探針有良好的細菌源性檢測通用性及物種特異性。

2.1.2 動物線粒體16S rRNA基因引物探針的通用性及特異性驗證

將提取的牛肉、豬肉、魚肉、雞肉DNA作為實驗組,同時以部分植物(杜仲、銀杏)和細菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)的DNA樣本作為對照組,進行熒光定量PCR檢測,結果顯示:牛肉、豬肉、魚肉、雞肉樣本的 Ct值分別為 11.30、14.80、26.66、26.02;選用的杜仲、銀杏、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及體系水對照樣本均無擴增曲線。雖然多次重復結果的陽性Ct值有細微改變,但各物種擴增結果相同。以上結果證明動物線粒體16S rRNA引物探針有良好的動物源性檢測通用性及物種特異性。

2.1.3 植物tRNA-leu基因引物探針的通用性及特異性檢測

將杜仲、紫葉桃、冬青、銀杏、滴水觀音、油菜、萵苣、綠蘿的DNA樣本作為實驗組,并取部分動物(雞肉、豬肉)和細菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)的DNA樣本作為對照組,進行熒光定量PCR檢測,結果如下:杜仲、紫葉桃、冬青、銀杏、滴水觀音、油菜、萵苣、綠蘿樣本的Ct值分別為19.00、13.85、24.55、22.13、15.45、12.88、11.64、12.93;選用的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞肉、豬肉以及體系水對照樣本均無擴增曲線。雖然多次重復結果的陽性Ct值有細微改變,但各物種擴增結果相同。以上信息證明tRNA-leu引物探針有良好的植物源性檢測通用性及物種特異性。

2.2 環(huán)境氣溶膠樣本的組分分析

使用3種管家基因引物探針對28份環(huán)境樣本進行熒光定量PCR檢測,取PCR酶體系水為空白對照,安全柜內采集的氣溶膠樣本為陰性對照,1.2章節(jié)選取的細菌、動物和植物中提取的核酸分別為相對應的陽性對照。熒光擴增曲線如圖1所示,具體Ct值見表3。結果表明,28份環(huán)境樣本均有細菌、動物和植物成分檢出,且有完整擴增曲線;陰性對照、空白對照的檢測結果均為undetected。

圖1 環(huán)境氣溶膠樣本的管家基因檢測結果(A)細菌成分檢測結果;(B)動物成分檢測結果;(C)植物成分檢測結果。各圖中陰性對照及空白對照均無擴增曲線,陽性對照擴增曲線完好。Fig.1 Housekeeping gene detection of environmental aerosol sample(A)Bacterial component testing;(B)Animal component testing;(C)Plant component testing.Negative control and blank control in each figure have no amplification curve,and the positive control amplification curve is intact.

2.2.1 空氣樣本中細菌、動物和植物三者成分間的比較

對收集到的樣本中細菌、動物和植物成分的相對含量進行分析(圖2)。結果表明,空氣中細菌、動物和植物來源的成分含量差異顯著(P=0.000＜0.05)。進一步兩兩比較可知,采集到的氣溶膠中細菌、動物、植物三者成分的相對含量存在差異,細菌最多,植物次之,動物成分最少。

圖2 空氣氣溶膠中細菌、動物和植物成分的Ct值散點圖Fig.2 Scatter plot of Ct values of bacterial,animal and plant constituents in aerosols

2.2.2 高度對空氣樣本中細菌、動物和植物成分的影響

按照采樣時的高度將采集樣本分為12層天臺(高度60 m)和后院地面(高度0 m)兩組。結果表明不同高度的空氣中細菌、動物、植物的成分含量均無顯著性差異(細菌P=0.365＞0.05,動物P=0.904＞0.05,植物 P=0.847＞0.05,圖 3)。

2.2.3 溫度對空氣樣本中細菌、動物和植物成分的影響

在樣品采集的一周內,溫度變化范圍為24～39℃,不同溫度條件下的空氣樣本中細菌、動物、植物成分的Ct值如圖4所示。結果表明:不同溫度下,空氣中動物、植物的成分含量無顯著性差異(動物 P=0.45＞0.05,植物 P=0.963＞0.05);溫度與細菌Ct值呈負相關(r=-0.434,P=0.021＜0.05),即溫度越高,細菌Ct值越低,采集到的細菌粒子越多。

2.2.4 濕度對空氣樣本中細菌、動物和植物成分的影響

在樣品采集的一周內,相對濕度變化范圍為15%～82%,不同濕度條件下的空氣樣本中細菌、動物、植物成分的Ct值如圖5所示。結果表明:不同濕度下,空氣中動物和植物成分的含量無顯著性差異(動物 P=0.463＞0.05,植物 P=0.956＞0.05);濕度與細菌Ct值呈正相關(r=0.660,P=0.000＜0.05),即濕度越低,細菌Ct值越低,采集到的細菌粒子越多。

表3 環(huán)境氣溶膠樣本管家基因檢測結果Table 3 Housekeeping gene detection results of environmental aerosol samples

圖3 不同采樣高度下各成分的Ct值Fig.3 Ct value of each component at different sampling heights

圖4 不同采樣溫度下各成分的Ct值Fig.4 Ct value of each component at different sampling temperatures

3 討論

生物氣溶膠的潛在危害性被越來越多的人重視,對生物氣溶膠的研究需要氣象學、分子生物學、細胞生物學、生物信息學等多個領域的技術[9～10]。眾所周知空氣微生物中的細菌如沙門氏菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌等感染會危害人類健康甚至生命[11],但空氣中存在的動植物源性成分對人類健康構成的潛在危害往往被人忽略:植物花粉會引發(fā)敏感人群的過敏反應[12];寄生蟲及蟲卵可引發(fā)人群傳染病[13];蚊蟲等生物是許多傳染病的傳播媒介[14]。目前對空氣中生物氣溶膠的研究主要針對細菌、真菌或病毒[15～18],缺少有效的手段對空氣中的各生物組分進行成分監(jiān)測。管家基因是一類在所有細胞中穩(wěn)定表達的基因,憑借其這一特性,管家基因成為研究基因表達的重要內參。管家基因常常作為分子標記被用于物種鑒別和生物摻雜鑒定:楊永存等[19]使用同源異形盒基因鑒別食用油中是否混有動物源性地溝油成分;18S rRNA基因被用于檢測明膠中的牛羊等動物源性成分[20];岳巧云等[21]使用leu基因作為檢測奶粉中是否摻入大豆成分的分子標記。

圖5 不同采樣濕度下各成分的Ct值Fig.5 Ct value of each component under different sampling humidities

本研究從生物管家基因角度出發(fā),借助自主研發(fā)的BIO Capturer-6病毒氣溶膠采集富集儀,建立了一種檢測生物氣溶膠樣本中動物、植物、細菌總成分相對含量的方法。通過對影響空氣中細菌、動物、植物成分采集的相關因素進行分析,一方面得出溫度和濕度對細菌的采集均有影響,隨著溫度的升高或濕度的降低,氣溶膠樣本中細菌Ct值逐漸降低,這可能是由于當溫度較高、濕度較小時,更有利于細菌在空中的懸浮,從而易于采集;另一方面,我們發(fā)現空氣氣溶膠中細菌、動物、植物三者成分的相對含量存在差異,即細菌最多,植物次之,動物最少,此結果可能與氣溶膠樣本中不同成分的粒徑大小有關,BIO Capturer-6對細菌類的小粒徑顆粒的采集效率優(yōu)于對動植物類較大粒徑顆粒的采集效率。