朱媛媛 郭海英* 孫振雙 徐道明 沈蘊茹 陶文靜 孫菁

1. 南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210000 2. 河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000 . 江蘇省中醫(yī)院針灸康復科, 江蘇 南京 210000

絕經(jīng)后骨質疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是由于婦女絕經(jīng)后雌激素分泌減少，相對穩(wěn)定狀態(tài)被破壞,骨重建偶聯(lián)過程失衡，所導致的全身性、代謝性骨病[1]。PMOP與其常見并發(fā)的骨折嚴重影響了絕經(jīng)后婦女的健康，其發(fā)病率預計會隨著壽命的延長而增長。溫腎固疏方以補腎壯骨為組方原則，臨床應用于PMOP的治療且安全有效。本研究通過建立PMOP大鼠模型，觀察溫腎固疏方對去卵巢大鼠成骨細胞Ⅰ型膠原(Col I) 代謝、破骨細胞組織蛋白酶K(cathepsin K,Cath K)表達的影響，探求溫腎固疏方治療PMOP的作用機制，以期為PMOP的防治提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 動物

健康9月齡未孕SPF級雌性SD大鼠48只,體重(350±30)g，由南京中醫(yī)藥大學實驗中心提供，合格證號SYXK(蘇)2014-0001-201508662。本實驗操作均于SPF級動物房完成,實驗過程中對動物的處置均依據(jù)科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 儀器、藥物及試劑

溫腎固疏方各中藥均購置于南京中醫(yī)藥大學百草堂，共7味藥：熟地、淫羊藿、枸杞、黨參、丹參、骨碎補、補骨脂，按比例配伍，煎煮濃縮; 戊酸雌二醇(德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司); 10%水合氯醛溶液(中國人民解放軍第一醫(yī)院)；青霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)；血清 I 型前膠原羧基末端前肽(PICP)、Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(ICTP)、Ⅰ型膠原交聯(lián)氨基末端肽(NTX)和Ⅰ型膠原交聯(lián)碳端肽(CTX)試劑盒(南京翼飛雪生物科技有限公司)；Col I、Cath K抗體(SAB公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 去勢大鼠骨質疏松模型的建立:用雙側性腺(卵巢)摘除法[2]制備PMOP大鼠模型。把SD大鼠隨機分為兩組: 假手術組(SHAM，n=8)和去卵巢組(OVX，n=40)。麻醉后在無菌條件下，固定大鼠使其呈俯臥位，OVX 組行背部切口剪除雙側卵巢，分層縫合。SHAM組大鼠行背部切口，切除卵巢旁脂肪1 g，不切除卵巢。最后每只大鼠經(jīng)后肢肌注8萬U青霉素,密切觀察一周。

1.3.2 分組及干預:隨機把OVX組大鼠分為5組，8只/組。分為:模型組、雌激素組、溫腎固疏方高、中及低劑量組。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，每周稱重1次。手術1個月后切口愈合，開始對大鼠分組干預。大鼠同類藥等效劑量按照成人的6.3倍計算，給藥容積0.5 mL/100 g。溫腎固疏方高劑量組:溫腎固疏方[21.21 g/(kg·d) 生藥]；中劑量組:溫腎固疏方[10.605 g/(kg·d) 生藥]；低劑量組:溫腎固疏方[5.3 025 g/(kg·d) 生藥];雌激素組:戊酸雌二醇[10 μg/(kg·d)];模型組和假手術組均給予生理鹽水0.5 mL/100 g灌胃。各組均連續(xù)灌胃2個月。

1.3.3 標本的釆集及測定: 大鼠末次灌胃給藥后，禁食24 h后取材。處死前稱量大鼠體重，腹腔注射10%水合氯醛溶液(35 mg/kg) 進行麻醉，右心室抽血處死。血液收集后，4 ℃靜置3 h，3 000 r/min 離心10 min，分離血清。用酶聯(lián)免疫法(ELISA)法檢測PICP、ICTP、CTX、NTX含量。骨標本收集:大鼠處死后，取左側股骨置于4%多聚甲醛中固定，待做石蠟切片，用于骨形態(tài)學觀察和免疫組化。腎臟收集后，待做石蠟切片，用于形態(tài)學觀察。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 骨組織形態(tài)學觀察

光鏡下觀察病理切片顯示，假手術組大鼠股骨形態(tài)正常，骨小梁結構正常，排列整齊且緊密，間隙較小(圖1 A);模型組與假手術組相比，大鼠骨小梁變細，存在連續(xù)性中斷，排列稀疏，間隙較大，視野中大量骨陷窩空泡，提示造模成功(圖1B);各干預組中，溫腎固疏方高劑量組大鼠股骨形態(tài)基本恢復正常，骨陷窩空泡消失。溫腎固疏方低、中、高劑量組和雌激素組與模型組相比，骨小梁結構有所恢復，骨陷窩空泡逐漸減少，且中藥組療效與濃度有關，高劑量組療效優(yōu)于中、低劑量組，見圖1C～圖1F。

圖1 溫腎固疏方對去勢大鼠骨形態(tài)的影響(HE，×200) TB:骨小梁；BM：骨髓腔; A：假手術組; B：模型組; C：雌激素組; D：溫腎固疏方低劑量組; E：溫腎固疏方中劑量組; F：溫腎固疏方高劑量組。Fig.1 Effects of the warming kidney and astringing formula on bone morphology in rats with osteoporosis (HE，×200) TB: trabecular bone;BM: bone marrow cavity;A:sham group;B:model group;C:estradiol valerate group;D: low-dose of the warming kidney and astringing formula group;E:middle-dose of the warming kidney and astringing formula group; F:high-dose of the warming kidney and astringing formula group.

圖2 溫腎固疏方對去勢大鼠腎臟組織形態(tài)的影響(HE,×200) GI：腎小球；RT：腎小管;A:假手術組; B:模型組; C:雌激素組; D:溫腎固疏方低劑量組; E:溫腎固疏方中劑量組; F:溫腎固疏方高劑量組。Fig.2 Effects of the warming kidney and astringing formula on kidney morphology of rats with osteoporosis (HE,×200) GI:glomeruli；RT：renal tubules.;A:sham group;B:model group;C:estradiol valerate group;D:low-dose of the warming kidney and astringing formula group;E: middle-dose of the warming kidney and astringing formula group; F:high-dose of the warming kidney and astringing formula group.

2.2 腎組織形態(tài)學觀察

假手術組未見腎間質炎細胞浸潤，腎小管結構完整，系膜細胞排列整齊，腎小管上皮細胞沒有變性壞死(圖2 A)；模型組出現(xiàn)彌散性腎間質炎細胞浸潤，系膜細胞增生，系膜區(qū)基質增多，腎小管基底膜明顯增厚，腎小管上皮細胞存在腫脹、變性及部分小管呈灶狀萎縮(圖2B)；中藥各組與雌激素組腎間質炎細胞浸潤減弱，腎小球基底膜增厚得到緩解,系膜細胞增生、系膜區(qū)基質增多有所減輕，見圖2C～圖2F。

2.3 血清骨轉化指標PICP、ICTP、NTX 和CTX的測定

假手術組與模型組相比較，血清ICTP、NTX、CTX明顯降低(P<0.01)，而PICP含量雖降低，但無統(tǒng)計學意義;與模型組相比較，雌激素組血清ICTP、NTX、CTX明顯降低(P<0.01)，PICP含量升高，但無統(tǒng)計學意義；溫腎固疏方低劑量組血清ICTP含量明顯降低(P=0.001)，NTX含量降低(P<0.01)，CTX含量降低(P=0.05)，PICP含量升高，但無統(tǒng)計學意義；中藥溫腎固疏方高、中劑量組血清ICTP、NTX、CTX顯著降低(P<0.01)，PICP含量明顯升高(P<0.01)。見表1。

PICP/ (ng/L)ICTP/ (ng/L)NTX/(nmol/L)CTX /(ng/L)假手術組6.00±0.66502.08±56.04*9.06±0.66*64.65±10.83*模型組6.71±0.441130.26±87.0914.79±0.73203.14±6.91雌激素組7.43±0.80561.91±44.95*10.01±0.48*62.10±16.02*中藥低劑量組6.65±0.77981.51±55.14*10.92±0.49*190.61±9.63△中藥中劑量組9.24±0.70*890.10±86.14*9.82±0.58*136.98±8.98*中藥高劑量組11.91±0.45*767.41±84.93*8.67±0.40*79.39±9.49*

注：與模型組比較,*P<0.01,ΔP=0.05。

2.4 溫腎固疏方對Col I蛋白表達的影響

Col I蛋白陽性染色呈黃色、棕黃色，為顆粒狀或纖維狀，主要在成骨細胞間質中，少量表達于骨細胞胞質中。病理顯微鏡下觀察各組染色切片可以發(fā)現(xiàn)，雌激素組、假手術組、中藥溫腎固疏方高、中及低劑量組Col I蛋白表達呈現(xiàn)陽性。與假手術組相比，模型組大鼠的皮質骨及骨小梁中染色略淺，溫腎固疏方高、中、低劑量組、雌激素組的灰度比模型組略有增加。免疫組織化學染色結果采用 Image Pro Plus6.0分析軟件做圖像分析，計算陽性區(qū)域的積分光密度(integra optical density，IOD) 計算其平均值。結果見表2、圖3。

Col ICath K假手術組28.84±0.88*16.78±0.64*模型組14.64±1.3965.98±1.13雌激素組26.9±0.90*20.80±0.98*中藥低劑量組18.46±1.14*55.16±1.50*中藥中劑量組22.18±0.77*43.76±1.29*中藥高劑量組25.88±1.72*22.62±1.48*

注：與模型組比較,*P<0.01。

2.5 溫腎固疏方對Cath K蛋白表達的影響

Cath K 蛋白陽性染色為棕黃色，主要在破骨細胞胞質中，少量陽性顆粒存在于成骨細胞細胞質。病理顯微鏡下觀察各組染色切片發(fā)現(xiàn)，與假手術組相比，Cath K 蛋白在模型組表達明顯增多；與模型組相比，Cath K 蛋白在中藥溫腎固疏方組和雌激素組表達顯著減少。結果見表2、圖4。

3 討論

絕經(jīng)后骨質疏松癥的發(fā)生與眾多因素相關，主要與卵巢功能的衰退、雌激素分泌減少密切相關?！端貑枴诽峒埃骸芭悠咂?，任脈虛，天癸竭”?！澳I主骨，生髓”，絕經(jīng)后婦女腎精虧虛，故骨骼不養(yǎng)，導致了PMOP的發(fā)生。補腎溫陽是中醫(yī)抗衰老及防治PMOP的共同治則，溫腎固疏方以溫腎壯骨為組方原則，臨床防治PMOP療效顯著。本課題組多項實驗及臨床研究，均證實了溫腎固疏方的療效，與模型組相比較，溫腎固疏方各治療組大鼠的骨密度(bone mineral density, BMD)均顯著升高(P<0.05)，骨形態(tài)學發(fā)生改變，并且從其抗氧化應激、調節(jié)炎細胞因子、調控ApoE水平的角度探討了溫腎固疏方抗PMOP的機制[3-5]。本次研究觀察到，中藥溫腎固疏方組可以通過抑制Cath K的表達來抑制Col I蛋白的分解，改善骨質疏松大鼠的骨結構。

圖3 溫腎固疏方對去勢大鼠骨組織Col I蛋白免疫組化染色結果(×200)Fig.3 Results of the warming kidney and astringing formula on immunohistochemical staining of Col I in bone tissue of rats with osteoporosis(×200)

圖4 溫腎固疏方對去勢大鼠骨組織Cath K蛋白免疫組化染色結果(×200)A：假手術組; B：模型組; C：雌激素組; D：溫腎固疏方低劑量組; E：溫腎固疏方中劑量組; F：溫腎固疏方高劑量組。Fig.4 Results of the warming kidney and astringing formula on immunohistochemical staining of Cath K in bone tissue of rats with osteoporosis (×200) A:sham group;B:model group;C:estradiol valerate group;D:low-dose of the warming kidney and astringing formula group;E:middle-dose of the warming kidney and astringing formula group; F:high-dose of the warming kidney and astringing formula.

現(xiàn)代醫(yī)學研究[6]發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后婦女雌激素的流失與骨的流失呈正相關，因此雌激素替代療法(HRT)是女性的主要骨骼保護方法。因易引發(fā)乳腺癌變和子宮內膜癌等不良事件，美國食品及藥物管理局(FDA)下達安全警告，并建議慎用雌激素替代療法用于預防和治療骨質疏松治癥[7]，臨床常用的其他西藥也副作用層出。近來，對于具有抗骨吸收以及與合成代謝相關的藥物研發(fā)日漸增多，比如以Cath K為靶點的抑制劑,擁有良好的應用前景。本課題組使用方藥為郭海英教授研制的溫腎固疏方，依據(jù)PMOP患者腎虛精虧，髓減骨枯為根本病機，建立補腎壯骨之法，兼補益脾氣，活血化瘀之效。本方由7 種藥物組成，以淫羊藿、熟地黃共為君藥，溫腎陽、滋腎陰；黨參健脾益氣；補骨脂脾腎雙補；丹參活血補血；枸杞、骨碎補補腎溫陽，填精益髓。全方共奏補腎壯骨、健脾益氣之功。藥理學研究[8-10]發(fā)現(xiàn)，淫羊藿、補骨脂、骨碎補等中藥存在有類雌激素樣作用的黃酮類物質。淫羊藿可以雙向調節(jié)骨代謝，淫羊藿總黃酮明顯下調PMOP大鼠的 Cath K 表達，促進COLI蛋白的合成,抑制骨吸收，減少破骨細胞陷窩形成，從而提高大鼠骨 BMD,改善骨質量[11-12]。補骨脂可有效的提高大鼠的血清骨鈣素含量[13]，此外，補骨脂中可能富含多個具有抑制 Cath K 活性作用的成分[14]。骨碎補提取物，與激酶抑制藥渥曼青霉素(WT)作用類似, 在骨吸收過程中抑制Cath K 前體的胞內轉運與表達[15-17],骨碎補總黃酮能增強骨組織COLⅠ的表達，降低骨轉換率[9]。研究表明[18-19]，丹參可以抗骨質疏松，其水提物主要成分丹參素可以顯著降低破骨特異性基因Cath K。

Col I是人體最豐富的膠原類型, 是主要的骨結構蛋白，占骨基質的 80%～90%。Cath K是參與骨吸收的一種關鍵蛋白酶，是破骨細胞中最主要、表達水平最高的細胞因子。具有活性的Cath K，降解一系列的骨基質成分，尤其是Col I蛋白[20]。Cath K降解Col I蛋白的N-端肽，產(chǎn)生NTX，降解Col I蛋白的 C-端肽，產(chǎn)生 CTX。血清和尿液中的 CTX 和 NTX 被認為最能反映骨膠原纖維降解并具有反映骨吸收最敏感、最特異的生化指標，且對骨質疏松癥患者的診斷和療效評估均具有重要意義[21]。原膠原羧基端的非膠原結構PICP，在膠原形成時被切除，水解成進入血液，所以，血液中PICP水平反映了膠原合成速率、成骨細胞的活性[22]。ICTP是成熟的Ⅰ型膠原交聯(lián)物的一部分,于Col I蛋白降解時釋放，其與Col I蛋白降解的比例為 1∶1。所以，血清中ICTP在反映骨吸收中是高度特異性的敏感指標。因此，聯(lián)合檢測血清中PICP 及 ICTP 的水平直接反映了骨Col I合成和降解狀態(tài)[23]。一旦Cath K在激活的破骨細胞中高度表達，骨基質成分會被快速降解，破骨細胞代謝增強、骨吸收加快，最終形成骨質疏松癥[24]。

PMOP患者血清Cath K水平增高, 與骨密度有很強的相關性[25], 由于Cath K在骨代謝中扮演著獨特的角色，過度表達會導致松質骨轉換增加，已成為近10年來全球代謝性疾病學術界的研究熱點[26]。通過阻止Cath K 表達可以抑制骨吸收及膠原分解，將有利于骨基質的穩(wěn)定性[27-28]。CathK抑制劑是一種新的治療方法，目前Cath K抑制劑的研發(fā)工作正在積極開展，其中一些抑制劑已通過臨床前研究，處于不同進展的臨床試驗階段。

本研究通過對去卵巢大鼠股骨形態(tài)觀察、相關骨吸收生化指標的測定，表明溫腎固疏方能夠通過下調破骨細胞Cath K的表達從而抑制去卵巢大鼠骨組織中Col I蛋白的降解，同時促進Col I蛋白的合成，降低骨代謝轉換率，改善骨小梁的結構，從而達到對絕經(jīng)后骨質疏松癥的防治作用。此外，對腎組織的觀察發(fā)現(xiàn)，溫腎固疏方不僅對腎功能無影響，還可以減輕PMOP大鼠存在的腎臟病理改變，改善絕經(jīng)后婦女腎精虧虛的癥狀，起到補腎填精的作用。然而，本次研究對象為PMOP大鼠，尚需與臨床試驗相結合。