徐瑩 田野

1. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽(yáng) 110004 2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院脊柱關(guān)節(jié)骨科，遼寧 沈陽(yáng) 110004

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids,GCs)是目前許多慢性疾病和自身免疫性疾病治療的首選藥物，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)締組織病、炎性腸道疾病、慢性阻塞性肺炎和哮喘等。調(diào)查表明，全世界約有1%～2%的不同年齡段患者接受長(zhǎng)期的GCs治療[1]。其副作用中，糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松(glucocorticoid induced osteoporosis,GIO)是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的主要原因[2]。由此帶來的低應(yīng)激性骨折，更是給患者帶來了巨大的痛苦和負(fù)擔(dān)。雖然GIO目前在臨床上已被廣泛認(rèn)知，但目前干預(yù)措施主要為發(fā)病后鈣劑、磷酸鹽的補(bǔ)充和骨折后的手術(shù)治療，其發(fā)生發(fā)展具體機(jī)制仍不明確。

正常生理狀態(tài)下，成骨與骨吸收處于平衡中。骨質(zhì)疏松是多種原因所導(dǎo)致的成骨受到抑制，骨吸收大于骨形成，進(jìn)而產(chǎn)生骨代謝失衡所致[3-4]。在成骨過程中，骨祖細(xì)胞作為骨組織的干細(xì)胞，分化為成骨細(xì)胞，參與骨代謝穩(wěn)態(tài)的維持[5]。有研究[6]證實(shí)，在間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化成骨細(xì)胞的過程中，不僅對(duì)成骨細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行補(bǔ)充，而且能通過細(xì)胞旁分泌的形式分泌內(nèi)源性生長(zhǎng)因子，進(jìn)一步促進(jìn)成骨。其分化過程是一個(gè)受到多種信號(hào)通路與細(xì)胞因子調(diào)控的復(fù)雜過程[7]。

在對(duì)MSCs成骨分化的調(diào)控中，Notch信號(hào)通路已被證實(shí)具有明顯的促進(jìn)成骨分化作用[8]，但在GIO中，Notch信號(hào)通路的作用仍不明確。本研究通過GCs對(duì)MSCs成骨分化的影響入手，明確在GIO發(fā)生發(fā)展中MSCs的功能變化，并進(jìn)一步驗(yàn)證Notch信號(hào)通路在這種變化中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人MSCs細(xì)胞系(Lonza Group 公司，美國(guó))；MSCGM 培養(yǎng)基(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium，Lonza公司，瑞士)；JAG1重組蛋白 (EnzoLife Sciences公司，美國(guó))， Alizarin Red 染色劑(北京索萊寶科技有限公司，中國(guó))；anti-Hes1，anti-ALP，anti-Collagen1，(Santa Cruz公司，美國(guó))；RNeasy 試劑盒(Qiagen公司，美國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))；Apo-ONE homogeneous Caspase-3/7分析試劑盒(Promeg Biosciences公司，美國(guó))；SYBR Green(Applied Biosystems公司，美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

將細(xì)胞以5 000 cell/mm2的密度接種于6孔培養(yǎng)皿的MSCGM培養(yǎng)液中，其內(nèi)加入10%胎牛血清、1% 青霉素溶液、5 mmol/L的L-Glutamine，置于37 ℃、5% CO2，6% O2的飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞70%～80%融合時(shí)，分別以生理鹽水(對(duì)照組)、地塞米松106mol/L(GCs處理組)、地塞米松106mol/L+JAG1(Notch信號(hào)通路配體激活，GCs+JAG1組)處理細(xì)胞。于孵育箱內(nèi)共同培養(yǎng)48 h。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 細(xì)胞凋亡分析：收取細(xì)胞，通過Apo-ONE homogeneous Caspase-3/7分析試劑盒，應(yīng)用multi-mode microplate reader軟件，以530 nm來測(cè)量吸收率，分析細(xì)胞凋亡情況。

1.3.2 RNA提取和real-time PCR檢測(cè)：應(yīng)用RNeasy試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，稀釋3倍后，取1 μL稀釋后的cDNA進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)。在95 ℃預(yù)變性15 min，同溫度下變性20 s，在58 ℃退火30 s，在72 ℃條件下延伸30 s，共計(jì)45個(gè)循環(huán)。于延伸階段檢測(cè)熒光產(chǎn)物，生成擴(kuò)增曲線。在每個(gè)同次反應(yīng)中，各組均設(shè)3個(gè)平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。以β-actin 為內(nèi)參基因，通過PCR儀RotorGene 分析軟件進(jìn)行定量分析。特異性引物序列見表1。

表1 特異性引物序列Table 1 Specific primer sequence

1.3.3 Western blot 蛋白表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用Goldenlysis buffer液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每泳道上樣40 μg。應(yīng)用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。轉(zhuǎn)膜后應(yīng)用5%的脫脂牛奶封閉，并與一抗4 ℃孵化過夜。一抗分別為anti-Hes1，anti-ALP，anti-Collagen1(1∶1 000，Santa Cruz.Cambridge, MA, USA)。次日PVDF膜在室溫下與二抗(中杉金橋，中國(guó))孵化2 h。應(yīng)用顯影液(賽默飛世爾科技，美國(guó))使蛋白條帶顯影。使用Image Quant 5.0 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行密度分析。通過應(yīng)用β-actin作為內(nèi)參來控制實(shí)驗(yàn)誤差。

1.3.4 茜素紅染色：培養(yǎng)48 h后除去細(xì)胞培養(yǎng)液，蒸餾水清洗3次；10%中性甲醛4 ℃條件下固定細(xì)胞20 min；吸除甲醛，蒸餾水清洗3次；加入Alizarin Red染色劑，于室溫下染色30 min；吸除染色劑，蒸餾水清洗3次；加入乙醇脫水，室溫下自然干燥過夜。顯微鏡下觀察，照相。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并按照SNK法進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，各組間比較采用t檢驗(yàn)；當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 GCs處理對(duì)MSCs凋亡的影響。

在GCs處理后48 h，通過應(yīng)用multi-mode microplate reader軟件，以530 nm波長(zhǎng)吸收率計(jì)數(shù)Caspase-3/7陽(yáng)性的細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率。筆者發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，GCs處理組凋亡細(xì)胞百分率明顯增加[(80±5.789)vs 對(duì)照組(60±7.132)，P<0.05]；而GCs+JAG1組則部分減少了凋亡細(xì)胞百分率(72±2.169)，與GCs組相比，P<0.05；與對(duì)照組相比，P<0.05，見圖1。

圖1 GCs處理對(duì)MSCs凋亡的影響(與對(duì)照組比較,*P<0.05;與GCs組比較,&P<0.05)Fig.1 Effects of GCs on MSCs apoptosis(vs control group,*P<0.05; vs GCs group,&P<0.05)

2.2 GCs處理對(duì)MSCs中Notch信號(hào)通路表達(dá)的影響

通過對(duì)各組MSCs的Hes1mRNA的RT-PCR檢測(cè)，與對(duì)照組相比，GCs處理組Hes1mRNA明顯降低(P<0.05)，JAG1的給予逆轉(zhuǎn)了Hes1mRNA的下降(與GCs組相比，P<0.05；與對(duì)照組相比，P>0.05)；通過Western blot檢測(cè)Hes1蛋白表達(dá)，與RT-PCR結(jié)果一致(見圖2a，圖2b)。

圖2 GCs處理對(duì)MSCs中Notch信號(hào)通路的影響(與對(duì)照組相比,*P<0.05;與GCs組相比,&P<0.05;與對(duì)照組相比,#P>0.05)Fig.2 Effects of GCs on Notch signaling in MSCs (vs control group,*P<0.05; vs GCs group,&P<0.05; vs control group,#P>0.05)

2.3 GCs處理對(duì)MSCs成骨分化的影響

在對(duì)各組MSCs成骨相關(guān)的指標(biāo)ALP、Collagen1的RT-PCR和Western blot檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)GCs處理組ALP、Collagen1的mRNA明顯降低，蛋白表達(dá)也同步下降，與對(duì)照組相比，P<0.05；在GCs+JAG1組，逆轉(zhuǎn)了上述下降(與GCs組相比，P<0.05；與對(duì)照組相比，P>0.05)，見圖3a～圖3c。在茜素紅染色的實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，GCs處理組染色明顯減弱(P<0.05)，GCs+JAG1組染色強(qiáng)度得到明顯改善(與GCs組相比，P<0.05；與對(duì)照組相比，P>0.05)，見圖4。

圖3 GCs處理對(duì)MSCs成骨分化的影響(與對(duì)照組相比,*P<0.05;與GCs組相比,&P<0.05;與對(duì)照組相比,#P>0.05)Fig.3 Effects of GCs on MSCs osteogenic differentiation (vs control group,*P<0.05; vs GCs group,&P<0.05; vs control group,#P>0.05)

圖4 GCs處理對(duì)MSCs茜素紅染色的影響(與對(duì)照組相比,*P<0.05;與GCs組相比,&P<0.05;與對(duì)照組相比,#P>0.05)Fig.4 Effects of GCs on Alizarin staining in MSCs (vs control group,*P<0.05; vs GCs group,&P<0.05; vs control group,#P>0.05)

3 討論

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松(GIO)是長(zhǎng)期或大劑量應(yīng)用GCs而產(chǎn)生的骨骼系統(tǒng)并發(fā)癥，是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的主要原因[2,9]。已有研究[10]證實(shí)，骨質(zhì)疏松發(fā)生的主要機(jī)制為骨代謝障礙，而GIO的具體發(fā)生發(fā)展機(jī)制目前仍不明確。本研究從GCs對(duì)成骨方面的影響入手，探討由此而產(chǎn)生的骨代謝失衡，及GIO的發(fā)病機(jī)制。

已有研究[6]證實(shí)，在骨代謝和骨重建的過程中，MSCs作為成骨細(xì)胞的重要來源，同時(shí)在骨組織局部通過細(xì)胞旁分泌方式釋放生長(zhǎng)因子，促進(jìn)成骨。在本實(shí)驗(yàn)中， GCs對(duì)MSCs的成骨分化標(biāo)志基因ALP和Collagen1的mRNA與蛋白水平表達(dá)，都具有明顯的抑制作用，而且增加了MSCs的凋亡，表明GCs對(duì)細(xì)胞成骨分化具有明顯的抑制作用。對(duì)于GCs體外應(yīng)用濃度的選擇上，筆者選擇了106mmol/L的地塞米松，這是基于對(duì)前期研究和文獻(xiàn)的查閱[11]，相當(dāng)于攝入5 mg/kg GCs(臨床常用的治療量)后的體內(nèi)血藥濃度。

體內(nèi)MSCs的成骨分化是一個(gè)由多種機(jī)制共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程。Notch信號(hào)通路近年來被證實(shí)廣泛參與體內(nèi)骨骼系統(tǒng)的成骨和血管生發(fā)過程，是MSCs成骨分化調(diào)控的重要機(jī)制。有研究[12]發(fā)現(xiàn)在Notch受體和配體突變的小鼠模型中，骨內(nèi)發(fā)生異常的血管構(gòu)建，骨生發(fā)減少，軟骨細(xì)胞異常，骨小梁減少和骨量缺失，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在JAG1涂層的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的MSCs中，細(xì)胞內(nèi)ALP等成骨標(biāo)志性基因表達(dá)顯著增強(qiáng)；當(dāng)沉默Notch信號(hào)通路時(shí)，細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)基因表達(dá)減弱[13]。在本次實(shí)驗(yàn)中，就GCs對(duì)MSCs中Notch信號(hào)通路的表達(dá)的影響進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)GCs對(duì)其具有明顯的抑制作用，這種抑制作用通過補(bǔ)充Notch信號(hào)通路配體JAG1而得到逆轉(zhuǎn)。并且，MSCs的成骨分化也因Notch信號(hào)系統(tǒng)的激活，得到一定程度的增強(qiáng)，提示Notch信號(hào)通路是GIO發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制之一。

綜上所述，本研究證實(shí)GCs能夠增加MSCs的凋亡，并抑制其成骨分化，其機(jī)制與GCs抑制MSCs中的Notch信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。對(duì)MSCs中Notch信號(hào)通路的進(jìn)一步研究將為GIO的干預(yù)治療提供新的靶點(diǎn)和思路。