張家國(guó) 徐曉峰 李明 王景靚

大連市第二人民醫(yī)院骨科，遼寧 大連 116011

低骨量與遺傳、營(yíng)養(yǎng)、生活方式以及雌激素水平和一些藥物的使用密切相關(guān)。在這些藥物中，糖皮質(zhì)激素具有強(qiáng)效的抗炎作用，并且已經(jīng)用于治療慢性疾病以及移植后免疫療法數(shù)十年[1]。目前皮質(zhì)類固醇的使用與嚴(yán)重的副作用有關(guān)，包括骨質(zhì)疏松癥和骨折增加[2]。盡管臨床上認(rèn)識(shí)到糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致骨質(zhì)流失，但許多長(zhǎng)期接受糖皮質(zhì)激素治療的患者未評(píng)估其骨骼健康狀況，也未接受特別的預(yù)防或治療[3-4]。糖皮質(zhì)激素直接作用于骨細(xì)胞，其主要作用之一是通過加速成骨細(xì)胞凋亡，減少成骨細(xì)胞的功能和數(shù)量[5]。Lucinda等[6]所述，成骨細(xì)胞的Bax表達(dá)在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥(GIO)中增加。眾所周知，細(xì)胞凋亡受內(nèi)在過程的調(diào)控，該過程涉及激活可促進(jìn)細(xì)胞死亡的基因[7]。同樣，Bcl-2基因家族編碼大量蛋白質(zhì)，包括參與程序性細(xì)胞死亡的Bcl-2基因家族的促細(xì)胞凋亡蛋白成員Bax[8]。生化標(biāo)志物在骨質(zhì)疏松癥的處理中也是重要的，骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BAP) 是其中之一，它是在成骨過程中從成骨細(xì)胞釋放到血液中的特定酶，被認(rèn)為是骨礦化過程的指標(biāo)[9]。雙膦酸鹽廣泛用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥[10]，然而，一些副作用如胃腸不耐癥和下頜骨壞死已有報(bào)道[11]。因此，需要尋找新的方法來治療當(dāng)前的疾病。植物雌激素在骨質(zhì)疏松癥的治療中顯示出顯著的結(jié)果[12]。同時(shí)，Trivedi等[13]表明銀杏葉提取物、山奈酚和槲皮素的植物雌激素成分參與骨骼的有益結(jié)果。銀杏葉(家庭銀杏科)是目前由接受不同治療方法的人群所使用的植物。該植物的主要化合物包含6%的萜類化合物(銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯)、低于5 ppm的銀杏酸和24%的植物雌激素。盡管目前缺乏臨床前研究以及使用銀杏治療骨質(zhì)疏松癥的臨床研究，但少數(shù)現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示在治療骨質(zhì)疏松癥方面其取得了令人鼓舞的結(jié)果[14]。銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract, Gbe)在治療骨質(zhì)疏松癥中可能起重要作用，部分作者報(bào)道了這種提取物的抗凋亡特性[14]。具體而言，Gbe在體外暴露于自由基的作用下可有效保護(hù)成骨細(xì)胞免于死亡。因此，銀杏對(duì)刺激成骨細(xì)胞分化和增加骨形成是有效的[14]?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，本研究旨在評(píng)估Gbe在生物化學(xué)標(biāo)志物BALP中的作用、對(duì)雙能X射線吸收測(cè)定法(DEXA)檢測(cè)骨密度(bone mineral density, BMD)以及用GIO處理的SD大鼠脛骨生物力學(xué)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SD大鼠(14周齡，重約250～290 g)從Juiz de Fora聯(lián)邦大學(xué)的動(dòng)物園獲得，它們?cè)谀抢锍錾⒎敝场?dòng)物置于帶有不銹鋼絲蓋和松木屑作為被褥的透明塑料籠中，生活在具有受控環(huán)境條件(12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，溫度22 ℃)的密閉通風(fēng)貨架上的動(dòng)物房中。所有動(dòng)物可以自由接近食物和水源。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

銀杏葉提取物注射液(臺(tái)灣濟(jì)生化學(xué)制藥廠股份有限公司生產(chǎn)，每支含有銀杏葉提取物17.5 mg，其中銀杏黃酮苷4.2 mg);阿侖膦酸鈉片(70 mg/片，杭州默沙東制藥有限公司)；地塞米松磷酸二鈉(上海北杰集團(tuán)關(guān)東藥業(yè)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在該實(shí)驗(yàn)中，隨機(jī)選擇60只14周齡的動(dòng)物，均勻分成5組：骨質(zhì)疏松組[OP組，給予地塞米松磷酸二鈉7 mg (kg·d)]；Gbe-1組[給予銀杏葉提取物28 mg (kg·d)聯(lián)合地塞米松磷酸二鈉7 mg (kg·d)]；Gbe-2組[給予銀杏葉提取物56 mg (kg·d)聯(lián)合地塞米松磷酸二鈉7 mg (kg· d)]；阿侖膦酸鈉組[ALN組，給予阿侖膦酸鈉0.2 mg (kg· d) 聯(lián)合地塞米松磷酸二鈉7 mg (kg·d)]和對(duì)照組(CON組);對(duì)照組未接受任何治療。每組再平均分為治療4周組與治療8周組。在骨質(zhì)疏松癥誘導(dǎo)4周后對(duì)ALN、Gbe-1和Gbe-2組進(jìn)行灌胃治療，每天一次。治療4周和8周后分別對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂死。用180 mg/kg和10 mg/kg劑量的賽拉嗪和氯胺酮進(jìn)行腹腔麻醉，心臟穿刺取血樣5 mL。收集血液后，通過總放血使動(dòng)物安樂死。將血樣在3 000 r/min下離心10 min，并將血清在-80 ℃保存直至分析。檢測(cè)血清骨特異性堿性磷酸酶(BAP)水平。取出右側(cè)脛骨并在-20 ℃下保存直至分析，然后在室溫下解凍4 h。

1.4 骨密度(BMD)檢測(cè)

脛骨的BMD使用DPX-ALPHA LUNAR TM1通過雙能X射線吸收測(cè)定法(DEXA)來測(cè)量。使用小動(dòng)物軟件進(jìn)行分析，并對(duì)骨進(jìn)行單獨(dú)評(píng)估。

1.5 生物力學(xué)參數(shù)

使用DL3000型通用機(jī)器EMIC對(duì)分離的右脛骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲測(cè)試評(píng)估。通用機(jī)器以5 mm/min的加載速率裝配2 000 N容量的測(cè)力傳感器。在右脛骨骨干彎曲試驗(yàn)中，支架兩點(diǎn)之間的距離標(biāo)準(zhǔn)化為三分之二的試樣，并且施加的負(fù)荷距各端等距。使用以下結(jié)構(gòu)-機(jī)械性能進(jìn)行測(cè)試：彈性(mJ)，其被定義為樣品在彈性相中允許的能量；最大載荷(N)和剛度(103N/m)，它被定義為表示結(jié)構(gòu)剛度的載荷和變形之間的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，使用單因素方差分析(ANOVA)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，然后進(jìn)行Tukey/Dunnett’T3事后檢驗(yàn)(對(duì)照組除外)。使用Student’st-檢驗(yàn)將對(duì)照組與骨質(zhì)疏松癥組進(jìn)行比較。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后BAP值的改變

治療4周和8周后，OP組和ALN組顯示BAP水平顯著降低(P<0.05)，Gbe-1、Gbe-2組的BAP水平明顯增加(P<0.05)，見圖1。

圖1 骨堿性磷酸酶(BAP)的水平(CON組與OP組比較，*P<0.05;除CON組外，所有組均與OP組進(jìn)行比較，**P<0.05)Fig.1 Bone alkaline phosphatase (BAP) levels

2.2 治療前后BMD的改變

OP組BMD明顯低于CON組(P<0.05)， Gbe-1、Gbe-2和ALN組的BMD在治療4周和8周顯著增加(P<0.05)，見圖2。

圖2 使用雙能X線吸收儀測(cè)量骨密度的結(jié)果(CON組與OP組比較，*P<0.05;除CON組外，所有組均與OP組進(jìn)行比較,**P<0.05)Fig.2 Measurements of bone mineral density (BMD) using a dual-energy X-ray absorptiometry bone densitometer

2.3 治療前后骨生物力學(xué)的改變

與CON組相比，OP組顯示大鼠脛骨剛度、最大載荷和彈性明顯降低(P<0.05)，Gbe-1，Gbe-2和ALN組的剛度、最大載荷和彈性在治療4周和8周后顯著增加(P<0.05)，見圖3。

圖3 三點(diǎn)彎曲測(cè)試的結(jié)果(CON組與OP組比較，*P<0.05;除CON組外，所有組均與OP組進(jìn)行比較,**P<0.05)Fig.3 Results of a three-point bending test

3 討論

據(jù)筆者了解，已經(jīng)進(jìn)行的那些用于評(píng)估Gbe在骨質(zhì)疏松癥中作用的臨床前研究，大多數(shù)以卵巢切除誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠為模型。此項(xiàng)研究是首次評(píng)估Gbe對(duì)GIO誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的影響。本研究的目的是通過骨生物力學(xué)和BMD來評(píng)估Gbe治療對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥恢復(fù)的效果。在本研究中，通過DEXA評(píng)估骨密度，DEXA是骨質(zhì)疏松癥臨床評(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)。筆者觀察到使用糖皮質(zhì)激素顯著降低了大鼠血清BAP、BMD、脛骨的最大負(fù)荷、彈性和剛度。用Gbe治療可有效恢復(fù)BAP、BMD水平，表明銀杏葉提取物可增加這些動(dòng)物的骨量。有研究表明[6]銀杏葉提取物可以減少成骨細(xì)胞的凋亡，而本研究中BAP水平降低在治療后得到恢復(fù)也證實(shí)了銀杏葉提取物可以促進(jìn)成骨細(xì)胞活性。

骨脆性可以通過生物力學(xué)參數(shù)來定義，并且受到骨轉(zhuǎn)換、微型結(jié)構(gòu)、礦化、微損傷、膠原交聯(lián)和礦物晶體結(jié)構(gòu)等多個(gè)因素的影響[15]。糖皮質(zhì)激素與快速和顯著的骨丟失以及骨折風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)。在本研究中，GIO不僅表明骨密度明顯下降，而且顯示骨的生物力學(xué)參數(shù)如骨剛度、最大負(fù)荷和彈性下降。Gbe和阿侖膦酸鈉不僅增加了BMD，脛骨的生物力學(xué)參數(shù)也有不同程度的改善。 Sliwiński等[16]的研究顯示阿侖膦酸鈉治療股骨干骨礦物質(zhì)含量增加；筆者的研究顯示阿侖膦酸鈉對(duì)脛骨干的力學(xué)性能影響顯著。另外，Sliwiński等報(bào)告，與去卵巢大鼠相比，股骨頸是一種以小梁骨為主的區(qū)域，其負(fù)荷顯著增加。這些結(jié)果表明阿侖膦酸鈉和Gbe對(duì)骨小梁和骨皮質(zhì)的影響都較大，皮質(zhì)骨存在于長(zhǎng)骨的骨干中，如同一些研究人員所得出的研究結(jié)果[17]，其缺乏骨密度和骨折風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性。

雖然BMD測(cè)量是骨質(zhì)疏松癥診斷中最重要的工具之一，但它越來越清楚地表明其并不能反映骨強(qiáng)度的所有成分。對(duì)于骨質(zhì)疏松癥的治療藥物，如雙膦酸鹽，已顯示其對(duì)骨密度的改善；然而，這些變化僅提供關(guān)于骨小梁損失或其數(shù)量的信息，并不能完全說明包括皮質(zhì)骨在內(nèi)結(jié)構(gòu)變化的機(jī)械性質(zhì)的改變[18]。例如，用利塞膦酸鈉治療的患者骨密度增加與骨折發(fā)生率無關(guān)[18]。但此次研究的數(shù)據(jù)顯示Gbe和阿侖膦酸鈉除了對(duì)BMD的改善，也會(huì)影響生物力學(xué)特性。據(jù)筆者所知，此次研究首次評(píng)估了Gbe對(duì)脛骨干骨生物力學(xué)參數(shù)的影響，結(jié)果表明Gbe顯著增加了生物力學(xué)參數(shù)。此次研究結(jié)果表明治療時(shí)間和Gbe的劑量雖然不足以完全恢復(fù)脛骨的皮質(zhì)骨，但是相同劑量和時(shí)間的Gbe治療對(duì)牙槽骨有著良好的效果[14]。Trivedi等[13]報(bào)道了較高劑量[100 mg (kg·d)] Gbe對(duì)卵巢切除大鼠的脛骨皮質(zhì)骨增加更為顯著。

總之，用GIO進(jìn)行治療將降低骨密度和骨生物力學(xué)參數(shù)，如骨硬度、最大負(fù)荷和彈性。此次研究的結(jié)果表明Gbe可以部分恢復(fù)大鼠的BMD，但脛骨生物力學(xué)參數(shù)沒有改善。