劉佳 周剛 陳丹娜 黃春霞*

1. 長沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410219 2. 中南大學(xué)生命科學(xué)院，湖南 長沙 410013

硫酸鈣(calcium sulfate, CaSO4)是使用歷史悠久且簡單的骨移植材料之一，已使用超過100年[1]，可應(yīng)用于口腔外科[2]、顱面外科[3]、骨科手術(shù)[4]，效果確定?？茖W(xué)界對于CaSO4利于骨再生主要有幾種解釋，CaSO4等鈣化合物材料在被植入后降解時，創(chuàng)造了富含鈣的環(huán)境，其所誘導(dǎo)的生物反應(yīng)與骨重塑過程中產(chǎn)生的生物反應(yīng)相似[5]。Walsh等[6]認為，在CaSO4吸收過程中產(chǎn)生的pH值降低會導(dǎo)致相鄰骨釋放骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)。此外也有課題組[1]提出，在CaSO4治療的部位增加了血管生成。目前，CaSO4成骨效應(yīng)的細胞機制和分子機制仍不十分清楚。

前期，筆者將間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)接種在脫蛋白骨支架上，對大鼠的臨界大小骨缺損模型進行修補[7]。筆者注意到，當沒有接種MSCs的脫蛋白骨支架作為對照組植入到骨缺損時，組織學(xué)切片可以觀察到豐富的宿主細胞進入支架。脫蛋白骨中起主要作用的成分是鈣。因此，本研究的目的是利用體外細胞培養(yǎng)的方式，探討CaSO4對MSCs成骨分化和遷移能力的直接作用，推測其中的聯(lián)系，探索構(gòu)建臨床實用的無細胞骨移植簡易支架的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物： SPF級KM小鼠，雌性，6～8周，體重(28±2) g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，長沙醫(yī)學(xué)院科研中心標準動物室飼養(yǎng)。

1.1.2 實驗儀器： 顯微鏡(奧林巴斯公司)；qRT-PCR分析(Thermo Fisher公司)在湘雅醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)院進行。

1.1.3 實驗試劑： TRIzol(Invitrogen公司)；高效反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taqman探針(Applied Biosystems公司)；CaSO4粉末、明膠(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 含CaSO4明膠預(yù)先包被細胞培養(yǎng)板：CaSO4按照0.1、0.8、1.5 g/L濃度溶于0.1%明膠/PBS中，設(shè)為高、中、低濃度組，經(jīng)70 μm孔徑的濾器過濾，包被培養(yǎng)板的孔。不含CaSO4的0.1%明膠/PBS溶液包被培養(yǎng)板為對照組。經(jīng)過處理的培養(yǎng)皿在4 ℃保存。

1.2.2 MSCs的分離和培養(yǎng)：小鼠實驗嚴格遵守長沙醫(yī)學(xué)院動物實驗的倫理條例進行。將小鼠麻醉后，以快速頸椎脫臼法處死，取出脛骨和股骨。剪去兩側(cè)關(guān)節(jié)頭，用培養(yǎng)基將細胞沖出，用DMEM(含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺和雙抗)對細胞進行培養(yǎng)。3 d后，更換培基，去掉未貼壁的細胞。當附著的細胞匯合到80%時，經(jīng)胰蛋白酶消化后傳代，2～4代細胞被用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞生長曲線：取對數(shù)生長期的細胞進行酶消化后，以6×104/mL的細胞密度接種于已經(jīng)包被有高、中、低濃度CaSO4/明膠的24孔板和對照組24孔板，均置6個平行孔培養(yǎng)細胞。用臺盼藍拒染法，每天計存活細胞數(shù)，共計10 d，據(jù)所獲平均拒染活細胞數(shù)繪制細胞生長曲線。

1.2.4 qRT-PCR分析：MSCs在含有高、中、低濃度CaSO4環(huán)境中培養(yǎng)1、4、7、10 d后收集細胞，用TRIzol法制備總RNA，用分光光度法進行RNA定量分析。按照高效反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，對純化的RNA進行反轉(zhuǎn)錄后，每個RT-PCR擴增體系使用50 ng的cDNA，每個樣品重復(fù)2次。使用Osterix因子和骨鈣素(Osteocalcin)作為探針、GAPDH 作為內(nèi)參對基因表達進行定量分析。相對定量數(shù)據(jù)fold induction以標準化單位表示。

1.2.5 刮痕合攏實驗分析細胞遷移：按照參考文獻[8]進行。在明膠/CaSO4包被的12孔板中接種1 mL密度為6×104/mL MSCs，培養(yǎng)至細胞匯合。然后，融合的細胞被最小平頭tip頭(0.1～10 μL)刮出痕跡，用培養(yǎng)基輕柔清洗，袪除脫落的細胞。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用奧林巴斯顯微鏡拍攝細胞遷移后，利用ImageJ軟件分析劃痕合攏程度。實驗重復(fù)4次。

1.2.6 瓊脂糖斑法分析細胞遷移：按照參考文獻[9]進行。低熔點瓊脂糖溶于PBS，制成1%瓊脂糖溶液，然后高溫。為制備瓊脂糖斑點，在1.5 mL的Eppendorf試管中加入100 μL融化的1%瓊脂糖溶液，再混合100 μL PBS或0.2、1.6、3 g/L 的CaSO4溶液，實驗組終濃度為0.1、0.8、1.5 g/L。細胞培養(yǎng)6孔板上點兩個2 μL的斑點，一個含CaSO4，一個則不含，4 ℃凝固10 min。MSCs進行胰蛋白酶消化后，取6×105個細胞均勻接種在含有斑點的培養(yǎng)皿中。細胞培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定，在顯微鏡下拍照，利用ImageJ軟件分析斑點區(qū)被侵襲的程度。實驗重復(fù)2次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 10.0軟件進行計量資料統(tǒng)計，多組比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CaSO4對MSCs生長曲線的影響

以活細胞數(shù)均值繪制的生長曲線顯示，各組均在第6～7天進入平臺期，CaSO4中、低濃度組細胞生長曲線和對照組相似，MSCs增殖未受到CaSO4影響。反倒是高濃度CaSO4組細胞生長受抑制，3～10 d活細胞遠低于其他組，生長曲線平緩，見圖1。

圖1 不同濃度CaSO4對細胞生長的影響Fig.1 Effect of CaSO4at different concentrations on cell growth

2.2 CaSO4對成骨基因表達的影響

在不同CaSO4濃度作用于細胞1、4、7、10 d后，筆者通過定量RT-PCR測定了各組Osterix因子和骨鈣素表達。如圖2 A、圖2B所示，中濃度0.8 g/L的CaSO4在1 d內(nèi)降低了Osterix的表達，而骨鈣素的表達量在1～4 d內(nèi)均略降低，Osterix因子和骨鈣素的mRNA的表達從第4～10天逐漸增加。這些結(jié)果表明，CaSO4對MSCs分化成骨細胞產(chǎn)生了雙重作用。1～4 d內(nèi)，CaSO4對成骨基因的表達有輕度的抑制作用，第4天是個分水嶺，4 d后漸進性上調(diào)Osterix因子和骨鈣素等成骨基因的表達。而高濃度1.5 g/L的CaSO4自始至終都在降低Osterix和骨鈣素的表達，提示高濃度的CaSO4抑制MSCs分化成骨細胞。低濃度0.1 g/L的CaSO4對成骨基因的表達影響不明顯。

圖2 不同濃度CaSO4對Osterix因子和骨鈣素表達的影響(與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01)Fig.2 Effects of CaSO4 at different concentrations on Osterix factor and osteocalcin expression(compared with the control group,*P<0.05，**P<0.01)

2.3 CaSO4誘導(dǎo)MSCs遷移

為了評估MSCs的遷移，筆者使用刮痕合攏實驗來檢驗在不同CaSO4濃度的影響下，令細胞遷移48 h后的情況。筆者觀察到CaSO4對MSCs遷移的影響與濃度密切相關(guān)。與對照組相比，0.8 g/L濃度下的細胞遷移最活躍(圖3B)，遷移后合攏面積達到了(81.1±3.5)%。而暴露于劑量高達1.5 g/L的高濃度組細胞遷移幅度小，合攏面積為(24.6±5.1)%，細胞本身的生長增殖狀態(tài)也較差，細胞稀疏而且胞質(zhì)中顆粒多(圖3 A)。低濃度組細胞的合攏面積為(49.8±4.4)%，遷移程度比對照組[(36.2±2.6)%]稍大(圖3C、圖3D)。

為了證實CaSO4對MSCs遷移的影響，繼續(xù)進行了瓊脂糖斑點試驗。在CaSO4中濃度時，觀察到細胞遷移程度更大，侵襲面積更大[(91.4±6.1)%]；CaSO4高濃度時，MSCs的遷移幅度小，侵襲面積[(18.8±10.4)%]甚至遠不及對照組[(50.5±8.0)%]和低濃度組[(59.7±9.4)%]。這些結(jié)果表明，體外CaSO4誘導(dǎo)的MSCs遷移與濃度依賴性相關(guān)，0.8 g/L可以有效的促進遷移。

3 討論

圖3 刮痕合攏實驗檢測CaSO4對MSCs的遷移能力的影響(每組上圖為遷移前，下圖為遷移后)Fig.3 Effects of CaSO4on the migration capacity of MSCs detected by wound healing assay (The images above are before the migration, and the images below are after the migration)

圖4 斑點實驗檢測CaSO4對MSCs的遷移能力的影響Fig.4 Effects of CaSO4on the migration capacity of MSCs detected by agarose spot experiment

復(fù)雜化的社會生活帶來了多樣化的危險，也帶了醫(yī)療新挑戰(zhàn)，例如高速交通工具事故可能帶來的多發(fā)性復(fù)雜骨損傷。骨損傷發(fā)生后，成骨誘導(dǎo)開始啟動。成骨誘導(dǎo)是指內(nèi)源或者外源的多能干細胞(主要是MSCs)受到外在因素的調(diào)節(jié)，分化形成成骨細胞等骨祖細胞的過程，是細胞水平和分子水平的多階段級聯(lián)反應(yīng)，包括細胞的趨化移動以及幾輪的細胞增殖和分化。在重塑骨過程中，骨基質(zhì)中常有大量的信號分子，這些可溶性信號形成的化學(xué)梯度創(chuàng)造了一個成骨誘導(dǎo)的微環(huán)境，促進骨祖細胞遷移進入骨再生區(qū)域。有研究[10]表明，BMP-2、BMP-4、PDGF及TGF-β等因子對MSCs遷移有促進作用。而BMP靶基因包括成骨細胞的轉(zhuǎn)錄因子如Osterix、Runx2[11]、Dlx3/5和 Smad 蛋白家族[12]，均對成骨細胞的分化和遷移至關(guān)重要[13]，也和骨質(zhì)疏松癥等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MSCs遷移是個復(fù)雜的多因素調(diào)控過程，對遷移有促進作用的因子還不止這些，鈣可能也是一個因素。

在前期實驗中，筆者將脫蛋白骨植入后，其中釋放的鈣可能成為基質(zhì)趨化因子，引起MSCs定向遷移，因此才能在沒有附著細胞的脫蛋白骨支架上看到實驗動物自身少量細胞遷移進去的現(xiàn)象[7]。因此，假設(shè)CaSO4可以作為一個引導(dǎo)信號，誘導(dǎo)正在成骨分化的細胞移動。CaSO4是微溶的，即使到飽和溶液，其離子濃度也不大，容易因吸收而變化。為此，此次實驗利用明膠作為鈣結(jié)合劑，提供一個鈣持續(xù)釋放的穩(wěn)定環(huán)境。

實驗中，筆者首先評估了CaSO4對MSCs增殖和分化的影響。中低濃度的CaSO4對MSCs增殖沒有明顯的影響，但是中濃度的CaSO4對MSCs分化產(chǎn)生了兩相效應(yīng)，開始時短暫抑制分化，CaSO4在1 d內(nèi)降低了Osterix的表達，而骨鈣素的表達量在1～4 d內(nèi)均輕度降低；隨后是成骨基因表達的逐步增加，經(jīng)過4～10 d的培養(yǎng)后Osterix和骨鈣素均增加，提示CaSO4促進了MSCs成骨分化。之后的細胞遷移實驗表明CaSO4有能力激發(fā)MSCs遷移，而且CaSO4濃度為0.8 g/L時效果最佳。另外筆者還觀察到，高濃度的CaSO4干擾了MSCs遷移。這和另外一個現(xiàn)象相印證，在受傷或炎癥部位的細胞外液中含有高濃度的鈣，不利于成骨分化和遷移，反而容易引起細胞凋亡[14]。

本研究結(jié)果表明，中濃度的CaSO4可以誘導(dǎo)MSCs成骨相關(guān)基因表達，可能促進干細胞的成骨分化，同時促進細胞遷移，強化祖細胞的招募，有利于完成對骨損傷區(qū)的修復(fù)。CaSO4支架有望成為無細胞的骨修復(fù)簡易支架。而未開啟成骨分化的MSCs的遷移顯著低于分化細胞，可能因為對趨化因子的反應(yīng)較低。Gonzalez課題組的研究[15]也表明，在以鈣為主的生物材料或培養(yǎng)基中存在額外的鈣離子，會使MSCs增強成骨基因表達和成骨細胞分化，與本研究結(jié)果一致。