唐 鏡，譚若蘭，呂中建，唐 斌，郭建敏

(1.西南醫(yī)科大學 藥學院，四川 瀘州 646000；2.成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司，四川 成都 610000；3.西南醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，四川 瀘州 646000)

1 引言

柚皮素(Naringenin)結(jié)構(gòu)如圖1所示，為白色針狀晶體，分子式C15H12O5，分子量272.25 g/mol，熔點260 ℃，溶于乙醇、乙醚和苯，幾乎不溶于水[1]。柚皮素分子顯中極性，由于分子內(nèi)含有苯環(huán)、羥基、羰基等官能團，所以在紫外區(qū)有吸收，吸收波長為325 nm[1]。

柚皮素存在于菝葜、化橘紅、枳實、桃葉[2]等天然植物中，一般以柚皮苷的形式存在于自然界中，柚皮素是柚皮甙的甙元，通?？梢酝ㄟ^水解糖苷鍵制備柚皮素。柚皮素具有抗菌[3]、抗氧化[4]、抗炎[4]、抗癌[5]、抗粥樣動脈硬化[6]、解痙和利膽等作用，可被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[7]。

圖1 柚皮素的化學結(jié)構(gòu)式

2 柚皮素的提取

2.1 酸水解法

原料先以水為溶劑，加熱提取柚皮苷或直接以柚皮苷作為原料，再通過無機酸或有機酸水解得到柚皮素的粗品，最后溶解于有機溶劑中進行柚皮素的純化。如張林鳳等[8]以干燥柚子落地果為原料，投入熱水中提取得柚皮苷，柚皮苷用鹽酸水溶液水解，得到柚皮素粗晶體，加入重量比1∶5的乙醇進行重結(jié)晶，實驗檢測，柚皮素得率達98%。李偉等[9]以破碎干燥的柚子皮為原料，水為溶劑加熱提取得柚皮苷提取液，再加入酸，加熱加壓水解，得柚皮素粗品，用低碳醇的水溶液進行重結(jié)晶，所得柚皮素純度>99.67%，柚皮素得率>85%。

樊振等[10]柚皮苷在低級醇或低級酮溶劑中的溶液在酸性條件下發(fā)生酸水解獲得柚皮素粗品，使柚皮素粗品溶解在無水乙醇或無水甲醇中，加活性炭脫色，分離提純，干燥后得柚皮素純度達99%。溫堯林等[11]將柚皮苷邊攪拌邊加入有機酸溶液中水解，獲得柚皮素粗品溶解在含有活性炭的50%～90%乙醇溶液中，抽濾干燥，柚皮素得率和純度均達98%。李玉山[12]在柚皮苷水解過程中加入抗氧化劑，得到柚皮素反應(yīng)物，冷卻沉淀，沉淀物以板框壓濾機壓濾，得柚皮粗品以一定量的有機溶劑溶解，加入活性炭脫色過濾，結(jié)晶干燥，得到柚皮素精品純度達98%。

陳雪峰等[13]以桃葉為原料，干燥粉碎，過60目篩，65%乙醇、料液比1∶35、溫度40 ℃、提取4 h，乙醇甲醇體積比7∶3、料液比1∶45(g∶mL)、溫度50 ℃、再次提取5 h，柚皮素平均獲得率為5.25%。

劉亞萍等[14]以化橘紅為原料，加入蒸餾水提取得柚皮苷粗品，再用水重結(jié)晶得精制柚皮苷，在精制柚皮苷中按1∶100加入2% H2SO4，冷卻加堿調(diào)pH值至中性，加入等量乙酸乙酯置于分液漏斗中萃取，濃縮后用乙醇重結(jié)晶，得柚皮素得率較低。

酸水解法設(shè)備簡單，試劑易獲得，柚皮素獲得率和純度高，方法優(yōu)化空間大，但有機溶劑用量大，步驟繁瑣，需反復(fù)結(jié)晶。

2.2 超臨界CO2萃取法

原料直接用超臨界CO2作為溶劑，再添加一定的夾帶劑，在一定條件下萃取出柚皮素。如洪昕[15]以干燥粉碎并過篩后的桃葉為原料，以一定量乙醇為夾帶劑，在溫度60 ℃，壓力30 MPa的條件下萃取6 h后，柚皮素提取率為2.18%。陳雪峰等[16]亦通過實驗證實此為最優(yōu)方案，其純度為36.33%。全燦等[17]以柑橘皮為原料加入料液比為1∶0.3的10%的乙醇溶液，沒泡12 h后，加入到萃取釜中靜態(tài)萃取0.3 h，再動態(tài)萃取3 h，收集得到柚皮素粗品，得率達78%，采用C18制備色譜柱進行純化，柚皮素純度達99.5%。

超臨界CO2萃取法與傳統(tǒng)的酸水解法相比較，提取率高、時間短、工藝簡單、操作方便，但所用的設(shè)備要求較高，投資大，萃取物含雜質(zhì)較多。以桃葉為原料時，萃取物中含大量的葉綠素。

2.3 酶水解法

以酶作為催化劑水解柚皮苷，得柚皮素粗品后添加有機溶劑中進行柚皮素的純化。如李曉鳳等[18]在緩沖溶液中加入有機溶劑或者離子液體(體積比1∶1～1∶5)，混勻后加入柚皮苷，以黑曲霉細胞為催化劑，得到粗產(chǎn)物，采用等體積的乙酸乙醋萃取3次，減壓蒸干，再加入甲醇溶解過濾，濾液在40 ℃下減壓干燥后, 得到純度達98%的柚皮素。朱必玉等[19]以柚皮苷為原料，在底物濃度為4.0 g/L、溫度為55 ℃、pH值為3.0的條件下加交聯(lián)柚苷酶聚集體18.0 mg/mL，反應(yīng)24 h后柚皮素得率為97.72%。

酶水解法工藝簡單，純度高，但用酶量大，價格昂貴，柚皮苷初始含量改變可能會導(dǎo)致后條件發(fā)生變化。

3 抗癌作用

3.1 抗胃癌

柚皮素(Nar)可明顯抑制人胃癌細胞系SGC-7901細胞的生長，可降低胃癌細胞內(nèi) MMP-2、MMP-9 的表達，對SGC-7901細胞株的增殖、黏附、侵襲和遷移能力有明顯抑制作用[20]，Nar的刺激能明顯提高caspase-3凋亡細胞活性，促進caspase-3以及PARP的表達，能夠明顯抑制Akt的磷酸化，提高p53蛋白的表達[21]，可降低抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達，增加促凋亡蛋白Bax和裂解的caspase-3的表達，進一步誘導(dǎo)胃癌細胞的凋亡[22]，作用呈時間-劑量濃度依耐性[21]。大量與腫瘤形成和發(fā)展相關(guān)的基因，證實是被β-catenin/Tcf信號激活。Nar能作用于β-catenin本身或下游成分，不激活胞質(zhì)b-catenin的降解途徑，抑制AGS胃癌細胞的β-catenin/Tcf信號[23]。Nar對胃癌的具體作用機制尚未明確，但其抗胃癌活性可以體現(xiàn)。Nar通過保護谷胱甘肽代謝酶、I期和II期異型生物酶，對MNNG誘導(dǎo)和S-NaCl促進的胃癌有抑制作用，對腫瘤的形成有預(yù)防作用[24]。

3.2 抗肺癌

Nar通過誘導(dǎo)人肺癌A549細胞DR5的表達[25]，抑制A549細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，抑制AKT活性和下調(diào)MMP-2和MMP-9，抑制A549細胞的遷移[26]，有明顯的時間-劑量濃度依賴關(guān)系[27]。抑制MAPKs/AP-1和IKKs/IκB/NF-κB 信號通路的協(xié)同活性，減弱A549 細胞中EGF誘導(dǎo)的MUC5AC黏蛋白分泌[28]。

Nar能誘導(dǎo)NcI-H2170細胞產(chǎn)生G1期阻滯，PARP蛋白表達量下降，抑制DNA的復(fù)制的同時無法進行DNA修復(fù)，從而抑制人肺鱗癌NcI-H2170細胞增殖，促凋亡因子Bid表達上調(diào)，Bcl-2表達下調(diào)，Procaspase-3、Procaspase-8被激活，誘導(dǎo)NcI-H2170細胞凋亡[29]。Qin等[30]發(fā)現(xiàn)小鼠口服Nar可明顯減少腫瘤細胞向肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量，T細胞的抗腫瘤活性增強，延長腫瘤切除小鼠的生存期。

3.3 抗肝癌

作用于人肝癌細胞系HepG2細胞后，Nar誘導(dǎo)HepG2細胞表面DR5受體表達上調(diào)，激活Caspase-8信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增強抗人DR5單克隆抗體對HepG2細胞的凋亡作用[31]。Nar作用于肝癌細胞(MHCC97-H)后，MMP-9表達明顯下降，E-鈣黏蛋白表達明顯升高，而N-鈣黏蛋白表達無明顯改變，抑制細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化能力從而抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力，促進肝癌細胞凋亡[32]。

3.4 抗乳腺癌

Nar通過下調(diào)Cdk4、Cdk6、Cdk7、Bcl-2、x-IAP和c-IAP-2，上調(diào)細胞中的p18、p19、p21、caspases-3、7、8和9、Bak、AIF和Bax來調(diào)節(jié)細胞周期基因的表達，使細胞周期停留在S期或G2/M期，誘導(dǎo)乳腺癌細胞(HTB26，HTB132)凋亡。同時降低細胞存活因子PI3K、pAkt、pIκBα和NFκBp65的表達水平，有明顯的時間-劑量濃度依賴關(guān)系[33]。Nar對MCF-7乳腺癌細胞的增殖和活力有影響，Nar靶向ERK，能抑制胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)磷酸化、改變ERA定位、抑制MAPK信號通路。但它也靶向參與細胞活力和凋亡的其他蛋白質(zhì)，可能以多種蛋白為靶點誘導(dǎo)其對細胞增殖和存活的影響[34]。Nar是一種潛在的PI3K抑制劑和MEK抑制劑，抑制胰島素誘導(dǎo) GLUT4易位的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子磷酸肌醇3-激酶(PI3K)的活性、受損的下游信號分子 Akt 的磷酸化、p44/p42 有絲分裂原活化蛋白激酶的磷酸化，抑制葡萄糖的攝取而抑制MCF-7 乳腺癌細胞的增殖[35]。柚皮素是一種弱雌激素激動劑，T47D-KBluc乳腺癌細胞表現(xiàn)出雌激素缺乏狀態(tài)[36]。柚皮素作用于表達或不表達的雌激素受體α(ERα)乳腺癌細胞系，發(fā)現(xiàn)柚皮素與 ERα結(jié)合作為拮抗劑降低了 ERα陽性細胞的數(shù)量[37]。

3.5 抗結(jié)腸癌

Nar通過p38激活增加轉(zhuǎn)錄激活和ATF3蛋白水平，而Nar介導(dǎo)的ATF3表達在部分程度上對人結(jié)腸癌細胞的凋亡有少量貢獻[38]。Nar通過下調(diào)Cdk4、Cdk6、Cdk7、Bcl-2、x-IAP和c-IAP-2，上調(diào)細胞中的p18、p19、p21、caspases-3、7、8和9、Bak、AIF和Bax來調(diào)節(jié)細胞周期基因的表達，使細胞周期停留在S期或G2/M期，誘導(dǎo)大腸癌細胞(SW1116,SW837)凋亡。同時降低細胞存活因子PI3K、pAkt、pIκBα和NFκ B p65的表達水平，有明顯的時間-劑量濃度依賴關(guān)系[33]。Jeong 等[39]還發(fā)現(xiàn)Nar誘導(dǎo)細胞周期蛋白D1的降解。

3.6 其他

Nar通過抑制胰腺癌細胞中TGF-B1/Smad3信號通路，下調(diào)了EMT標記物在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達，抑制了胰腺癌細胞的遷移和侵襲[40]。Nar在SUN-213細胞中可能抑制PRDx-1Y途徑促進胰腺癌細胞凋亡[41]。

Nar是一種新型的MMP-2抑制劑，可能具有抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移的潛力[42]。

Nar對前列腺癌細胞的增殖和遷移有明顯的抑制作用，還能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT和抑制ERK 1/2、P38和c-Jun N端激酶(JNK)細胞信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡，實現(xiàn)Ell系依賴性。在PC3細胞中，柚皮素可引起MMP的丟失和內(nèi)源性AP的ROS的生成，而在不影響MMP的情況下，可誘導(dǎo)LNCaP細胞產(chǎn)生ROS[43]。Aktas等表明[44]柚皮素抑制細胞遷移和侵襲的濃度對細胞沒有毒性作用或阻止生長，但是對由SCN9A基因直接或間接編碼VGSC具有抑制活性，從而抑制前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移性行為。Gao等[45]證實了Nar能刺激氧化應(yīng)激后LNCaP前列腺癌細胞BER酶基因的表達，這種刺激反過來導(dǎo)致通過定量8-OH-DG/106DG水平確定的增強的DNA修復(fù)。

4 柚皮素的量子化學研究

劉科梅等[46]使用密度泛函理論(DFT)中的B3LYP方法，在6～31G (d, p)基組水平上對柚皮素進行研究，結(jié)果表明柚皮素的抗氧化活性位點主要是 4’-OH、5-OH 以及7-OH 3個基團，其中4’-OH的活性最大。柚皮素的溶劑效應(yīng)、與信號蛋白的相互作用等量子化計算未見報道。近年來量子化學研究溶劑效應(yīng)的兩種方法分別是自洽反應(yīng)場(SCRF)理論計算法和量子力學、分子力學結(jié)合模型(QM-MM模型)計算法[47]。量子化學研究分子間相互作用的方法主要有DFT、abinitioI-IFSCF和微擾MP2等。相比之下DFT計算方法既考慮了電子相關(guān)性，與MP2相比也不是太費時，計算精度與MP2相當，是研究分子間弱相互作用，特別是大體系相互作用比較理想的理論工具[48]。

5 結(jié)語

柚皮素的提取方法中，3種方法各有優(yōu)缺點，可根據(jù)自身實驗環(huán)境條件和得率、純度的要求進行的選擇。

Nar對胃癌(SGC7901)、肺癌(A549、NcI-H2170)、肝癌(HepG2、MHCC97-H)、乳腺癌(HTB26，HTB132、T47D-KBluc)、結(jié)腸癌(SW1116，SW837)、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌細胞等有抗增殖、抗黏附、抗侵襲和抗遷移能力。在Nar的作用下，caspase家族、bcl-2、bax、ALF、MAPK通路、周期蛋白依賴性激酶等生長凋亡調(diào)控相關(guān)的表達在癌細胞中活性增強，促進癌細胞凋亡。Nar可能以多種蛋白為靶點，調(diào)節(jié)信號通路，但具體作用機制尚未明確。

目前，柚皮素的抗氧化活性點已通過DFT方法計算得出。探究柚皮素在抗癌過程中的分子機制與相互作用，為柚皮素的藥物研發(fā)與臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，量子化學理論計算方法擁有良好的應(yīng)用前景。