任季平，李發(fā)康，丁有來，王 雪，薛應(yīng)鈺

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

微生物是土壤肥力的核心，土壤中的微生物不僅數(shù)量巨大，而且種類極多，許多微生物對土壤氮，磷和鉀等養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和供給起非常重要的作用[1]。木霉(Trichodermaspp．)和青霉(Penicilliumspp．)是土壤中廣泛存在的絲狀真菌，由于其具有防病、促生和解磷等多種功能，在生產(chǎn)上已經(jīng)廣泛應(yīng)用。張曼曼等[2]從土壤中分離篩選到5株具有很好解磷能力的木霉菌株，其中木霉T-404的解磷效果最好，為109.22 mg/L。也有研究表明，哈茨木霉(T．hatzianum)和康寧木霉(T．koningii)能夠顯著提高馬鈴薯、煙草和紅蘿卜的發(fā)芽率，出苗率及干重[3]，長枝木霉T6 菌株(T．longibrachiatum)分生孢子懸浮液能夠顯著提高3種禾本科和3種豆科牧草幼苗的生長和相關(guān)生理效應(yīng)酶的活性[4]。淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)殺線活性與化學(xué)殺線劑相比無明顯差別，甚至超過化學(xué)殺線劑[5]，該菌可寄生一些植物線蟲的卵、幼蟲及成蟲，對南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)的卵寄生率高達60%～70%[6-7]。因此，木霉和青霉是理想的生物肥料菌種。

微生物之間存在著協(xié)同、競爭、拮抗、捕食等作用。早在1925年就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同菌株組合混合培養(yǎng)可以形成不同的產(chǎn)物。研究認為混合培養(yǎng)能減少或避免純培養(yǎng)過程中生物活性下降的現(xiàn)象，增加培養(yǎng)菌生物量，獲得更多的菌株性質(zhì)[8]。韓梅等[9]對根瘤菌S-2、溶磷菌P-3和硅酸鹽細菌K-5共3株菌進行兩兩復(fù)合及三菌復(fù)合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)兩兩復(fù)合培養(yǎng)的溶磷能力比各菌單獨培養(yǎng)溶磷能力要提高25.50%，51.54%和26.99%，并且三菌復(fù)合培養(yǎng)溶磷效果提高最顯著；韓梅等[10]報道溶磷菌GY+硅酸鹽細菌JY組合較單個菌株GY、JY單獨培養(yǎng)解磷量增加了77%和52%。微生物之間存在的協(xié)同作用是一個潛能巨大的新的微生物資源，正在逐漸成為新的研究熱點。

木霉T6和青霉K菌株是甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病原學(xué)實驗室分離并保存的具有防病、溶磷和促生等多功能菌株。前期研究表明，以Ca3(PO4)2為唯一磷源，木霉T6菌株15 d的解磷量為90.01 μg/mL，對尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌的抑制率分別達89.46%和94.11%[11]；以木霉T6和青霉K菌株為供試材料，研究其單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)后發(fā)酵液的解磷和促生能力，旨在擴大兩種菌株的生物功能，為后期二者相關(guān)生物制劑的研制提供重要的理論依據(jù)，也為復(fù)合微生物肥料的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 木霉(Trichodermasp.)T6菌株與青霉(Penicilliumsp.)K菌株，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實驗室提供。

1.1.2 供試種子 小麥種子西農(nóng)979和白菜種子春鳴均購買于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL[3]。

解磷培養(yǎng)基(NBRIP)[12]：(NH4)2SO40.5 g ，NaCl 0.3 g，F(xiàn)eSO40.03 g，MnSO40.03 g，KCl 0.3 g，MgSO4.7H2O 0.3 g，Ca3(PO4)20.5 g，葡萄糖 10 g，pH 7.0～7.5 ，固體培養(yǎng)基加2% 的瓊脂粉，115℃ 滅菌30 min備用。

1.2 方法

1.2.1 菌株間拮抗反應(yīng) 將預(yù)先培養(yǎng)好的木霉T6和青霉K菌株用打孔器打取直徑為5 mm的菌餅，然后將其接種于PDA固體平板，25℃對峙培養(yǎng)7 d，觀察交界處兩菌株的生長狀況，若交界處兩菌株生長弱或不生長，說明兩菌株間有拮抗作用，不適合進行混合培養(yǎng)；若交界處兩菌株生長良好，則說明兩菌株可以共存，兩者相互沒有抑制作用，不發(fā)生拮抗反應(yīng)，可以進行混合培養(yǎng)[13]。

1.2.2 木霉T6菌株和青霉K菌株混合培養(yǎng)后解磷能力測定 將活化后的木霉T6菌株和青霉K菌株分別轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5 d，加入10 mL已滅菌的蒸餾水并滴入0.05 mL 吐溫-80，緩慢搖晃，使分生孢子充分脫落，用無菌水將洗脫液稀釋成濃度為 108cfu/g分生孢子懸浮液，備用。

混合培養(yǎng)時各取木霉T6菌株和青霉K菌株的菌液0.5 mL接種于盛有100 mL NBRIP液體培養(yǎng)基的三角瓶中，單一培養(yǎng)時每個菌液各取1 mL分別接種于盛有100 mL NBRIP液體培養(yǎng)基的三角瓶中，設(shè)不接菌為對照，每個處理重復(fù)3 次，置于28℃，150 r/min搖床培養(yǎng)10 d，分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d后過濾，濾液8 000 r/min離心10 min，上清液用磷鉬藍分光光度法[14]測定可溶性磷含量，同時用pHS-29A 型酸度計直接測定培養(yǎng)液的pH并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 木霉T6菌株和青霉K菌株混合培養(yǎng)后的促生作用 挑選飽滿且大小一致的小麥種子和白菜種子，將其用5%NaClO消毒5 min，并用無菌水沖洗5次。然后將消毒的種子均勻擺放在鋪有一層紗布和兩層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)內(nèi)，每個培養(yǎng)皿100粒，共2皿，待發(fā)芽后種入盛有預(yù)先滅過菌土壤的花盆中，小麥和白菜各種20盆，每盆10株，各進行4組處理，分別澆木霉菌液5 mL，青霉菌液5 mL，青霉和木霉混合培養(yǎng)液5 mL以及無菌水5 mL，3 d后再補澆1次，第7 d進行幼苗生理生化指標(biāo)的測定。

幼苗形態(tài)指標(biāo)測定 隨機從各處理中抽取25株幼苗，洗凈吸干水分后用直尺測定幼苗株高、根系長度和整株鮮重。然后將其置于105℃殺青30 min，70℃烘至恒重，并稱其干重。

葉綠素含量測定 選取生長發(fā)育正常，無病蟲害，無干葉的小麥和白菜的植株葉片，剪碎混勻之后，準(zhǔn)確稱取0.500 g樣品于研缽中充分研磨后，加入95%的無水乙醇過濾到25 mL的容量瓶中，測定其葉綠素a和葉綠素b的D665 nm和D649 nm值，按公式計算葉綠素的含量[15]。

Ca=13.95D665 nm-6.88D649 nm，Cb=24.96D649 nm-7.32D665 nm

葉綠素的含量(mg/g)=(C×V) / (1000×W)

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗測定

菌株拮抗測試顯示，木霉T6菌株和青霉K菌株在同一PDA平板上生長情況與二者單獨培養(yǎng)時無明顯差異，二者菌絲可以相互融合后正常生長。說明木霉T6菌株和青霉K菌株相互之間無拮抗反應(yīng)，可以混合培養(yǎng)。

2.2 木霉T6菌株和青霉K菌株混合培養(yǎng)后解磷能力測定

木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)后的溶磷能力強于其單獨培養(yǎng)的溶磷能力，且均隨著培養(yǎng)時間的延長溶磷能力逐漸增強，到一定時間又趨于穩(wěn)定。木霉T6于第8 d的溶磷量最大，達90.91 μg/mL；青霉K于第7 d的溶磷量最大，為521.21 μg/mL；木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)1～6 d溶磷量隨培養(yǎng)時間的延長不斷增大，混合培養(yǎng)的溶磷量較木霉T6和青霉K單獨培養(yǎng)時的解磷量增加了646.52%和17.82%，且第7 d時達到最大值，為614.06 μg/mL；第7 d后略有下降但相對保持穩(wěn)定，基本維持在560 μg/mL(圖1)。因此，用第7 d的培養(yǎng)液進行盆栽試驗。

圖1 木霉T6菌株和青霉K菌株混合培養(yǎng)后的解磷效果Fig.1 Effect of phosphorus-dissolving after mixed culture ofTrichodermaT6 strain andPenicilliumK

2.3 木霉T6菌株和青霉K菌株混合培養(yǎng)后發(fā)酵液的pH值變化

木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)后發(fā)酵液的pH值低于木霉T6和青霉K單獨培養(yǎng)的pH值，且隨著培養(yǎng)時間的延長pH值均呈逐漸降低趨勢并趨于穩(wěn)定。木霉T6發(fā)酵液的pH最初為6.7，第6 d為6.1，之后維持在6.2；青霉K發(fā)酵液的pH最初為6.4，第7 d最低，為5.3，之后維持在5.6～5.7；木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)后發(fā)酵液的pH最初為6.3，第7 d時為3.3，之后維持在3.5(圖2)。結(jié)合文中2.2可知，在1～10 d的培養(yǎng)時間，各處理溶磷量的變化趨勢與其各自發(fā)酵液pH的變化趨勢相反，其溶磷量最大時，pH值均最低。

圖2 木霉T6菌株和青霉K菌株混合培養(yǎng)后發(fā)酵液的pH值Fig.2 Changes in pH of fermentation broth after mixed culture ofTrichodermaT6 strain andPenicilliumK

2.4 木霉T6菌株和青霉K菌株混合培養(yǎng)后發(fā)酵液的促生作用

2.4.1 小麥和白菜幼苗形態(tài)指標(biāo)測定結(jié)果 木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)能顯著促進小麥和白菜幼苗的生長。經(jīng)木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)液處理過的小麥，其株高和根長分別較對照增長54.34%和33.15%，鮮重和干重較對照分別增長43.48%和23.81%。同時，用木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)液處理過的小麥較用木霉T6菌液和青霉K菌液單獨處理過的小麥株高、根長和干鮮重均有所增加(圖3)；白菜的幼苗形態(tài)學(xué)測定結(jié)果表明，經(jīng)木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)液處理后表現(xiàn)出了同小麥相似的促生效果(圖4)。用木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)液處理后，白菜的株高、根長、鮮重及干重分別較對照增加到306.80%，190.30%，162.5%和133.3%，促生作用極顯著。而且混合培養(yǎng)液的效果顯著高于單獨培養(yǎng)菌液處理的效果。所以木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)后的發(fā)酵液具有較好的促生作用。

圖3 不同處理下小麥幼苗的生長Fig.3 Effect of different treatments on the growth of wheat seedlings 注：A.CK；B.青霉K；C.木霉T6 ；D.木霉T6+青霉K

圖4 不同處理下白菜幼苗的生長Fig.4 Effect of different treatments on the growth of cabbage seedlings 注：A.CK；B.青霉K；C.木霉T6 ；D.木霉T6+青霉K

表1 不同處理下小麥和白菜幼苗的生長

注：同列數(shù)字后不同小寫字母分別表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),下同

2.4.2 小麥和白菜幼苗葉綠素含量測定結(jié)果 葉綠素含量測定結(jié)果表明，經(jīng)木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)液處理過后，小麥和白菜的葉綠素含量均顯著增大。用混合培養(yǎng)液處理后的小麥葉綠素a和葉綠素b的含量較對照分別增加42.70%和981.03%，較單獨木霉T6菌液和青霉K菌液處理有一定增加；用木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)液處理白菜后，其葉綠素a、葉綠素b含量較對照分別增加355.22%和717.39.78%。葉綠素a和葉綠素b總量較對照、木霉T6菌液和青霉K菌液處理分別增加447.78%，81.92%和61.11%(表2)。

表2 不同處理下小麥和白菜幼苗的葉綠素含量

3 討論

磷素作為植物生長發(fā)育所必需的大量元素，廣泛存在于土壤當(dāng)中，但是卻很難被植物所吸收，土壤中的微生物通過協(xié)同作用對磷進行轉(zhuǎn)化，進一步被植物利用。目前已發(fā)現(xiàn)大量具有解磷作用的微生物，且微生物之間存在著協(xié)同作用，這是一個潛能巨大的新的微生物資源。劉青海[16]研究表明，6株溶磷菌和4株固氮菌兩兩混合培養(yǎng)時，大多數(shù)混合體系溶磷能力增強。管國強等[17]研究表明，混合培養(yǎng)菌的溶磷能力比各菌單獨培養(yǎng)時要高。萇豹[18]研究發(fā)現(xiàn)多種解磷、解鉀、固氮菌混合發(fā)酵制備的菌糠菌肥比使用單一的解磷、解鉀、固氮菌制備的菌糠菌肥的效果更好。試驗測定了木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)后解磷能力的大小，結(jié)果表明，木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)的解磷效果好于木霉T6和青霉K單獨培養(yǎng)的解磷效果，其中，第7 d時的解磷量最大，達614.06 μg/mL，較木霉T6和青霉K單獨培養(yǎng)時的解磷量增加了646.52%和17.82%。解磷菌溶解無機磷的機理主要有產(chǎn)酸作用、胞外多糖協(xié)同作用與NH4+的同化作用等[19]，有研究報道[20]，解磷菌融磷量與培養(yǎng)介質(zhì)pH之間存在顯著的相關(guān)性，王光華等[20]研究表明，不同溶磷菌株之間溶磷效率與其培養(yǎng)濾液pH之間不存在必然的相關(guān)性，但同一菌株的溶磷效率與培養(yǎng)濾液的酸度成正相關(guān)。試驗發(fā)現(xiàn)，木霉T6、青霉K以及二者混合后的融磷量與各自對應(yīng)菌液的pH變化趨勢相反，進一步表明解磷菌株融磷量與培養(yǎng)介質(zhì)pH值存在一定聯(lián)系。

張萌[21]研究表明，AiL3和CⅢ-1混合發(fā)酵液對辣椒植株種子的生長有一定的作用，但與單菌液相比效果相差不大。相反，趙雅峰等[22]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸克雷伯氏菌Rs-5與枯草芽孢桿菌組合BCL-8按適當(dāng)比例復(fù)配對鹽脅迫條件下的棉花具有顯著的促生作用。以小麥和白菜為盆栽試材，研究了木霉T6和青霉K混合培養(yǎng)后發(fā)酵液的促生作用。結(jié)果表明，兩株菌混合培養(yǎng)后對小麥和白菜均有顯著的促生作用，其效果明顯高于二者單獨處理和對照，混合培養(yǎng)液可以有效提高小麥和白菜的生長速率，并且葉綠素含量也較對照顯著增加。

通過測定木霉T6與青霉K混合培養(yǎng)后的解磷能力及對小麥和白菜幼苗的促生作用發(fā)現(xiàn)，二者混合培養(yǎng)后的解磷能力及促生效果均較單一培養(yǎng)時有顯著提高。為后期混合制劑的研制奠定了基礎(chǔ)，也為生防菌株的復(fù)合利用提供了重要的理論依據(jù)，但本研究僅對禾本科和十字花科中的典型代表小麥與白菜作了盆栽試驗，供試材料較少，而未對其他的植物做研究，其促生作用是否依然顯著有待于進一步研究。

4 結(jié)論

試驗研究了木霉T6與青霉K混合培養(yǎng)后的解磷能力及促生作用，發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)后溶磷能力及促生功能有了明顯的提高。解磷試驗結(jié)果表明：木霉T6與青霉K混合培養(yǎng)的解磷量較各自單獨培養(yǎng)分別增加了646.52%和17.82%。盆栽試驗結(jié)果表明，二者混合培養(yǎng)發(fā)酵液對小麥和白菜具有明顯的促生作用，小麥和白菜的葉綠素、鮮重等生理指標(biāo)的較CK顯著增加。因此，木霉T6與青霉K菌株混合培養(yǎng)具有很好的溶磷促生作用，對后期二者混合生防制劑的研制及其他方面的應(yīng)用具有重要的理論意義。