保靖夫 佘琴英 竇為娟 盧穎輝 唐 蓉 楊 帆 劉 豐 王 根 劉志紅 鄭春霞

心腎綜合征(CRS)是指心臟或腎臟中任何一個器官損害導(dǎo)致另一器官出現(xiàn)功能障礙的臨床綜合征。其中，由慢性腎臟病(CKD)引起的心血管病變被急性透析質(zhì)量指導(dǎo)組(ADQI)劃分為Ⅳ型CRS[1]。大量研究顯示，Ⅳ型CRS是CKD患者最常見的死因[2]。因此，Ⅳ型CRS模型構(gòu)建，對深入研究Ⅳ型CRS的分子病理機制、進而提高其防治水平并改善CKD患者預(yù)后具有重要意義。

左心室肥厚(LVH)是Ⅳ型CRS患者最常見的心血管病變，也是患者出現(xiàn)充血型心力衰竭、心律失?；蛉毖孕募〔〉牟±砘A(chǔ)[3-4]。CKD所致LVH是Ⅳ型CRS的主要研究對象。目前大部分相關(guān)實驗均采用5/6腎切除制備Ⅳ型CRS模型，但不同實驗卻給出了不同的成模時間(2～5周不等)[5-7]。這提示5/6腎切除構(gòu)建的Ⅳ型CRS模型的穩(wěn)定性不足，給相關(guān)研究帶來不確定因素。本實驗在5/6腎切除 CKD模型的基礎(chǔ)上，采用7/8腎切除構(gòu)建CKD模型，對其腎功能及心臟的病理生理指標進行動態(tài)評價，以期制作成功率高、穩(wěn)定性強的Ⅳ型CRS模型。

材料與方法

實驗動物清潔級雄性Sprague Dawley (SD)大鼠39只，體重150～160 g，由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。

主要試劑異氟烷(河北一品制藥有限公司)；4%中性甲醛溶液(Solarbio)；HE染色試劑盒(Solarbio)；Masson染色試劑盒(Solarbio)；RNA提取試劑盒(Ambion)；qPCR試劑盒(Takara)；麥胚芽凝集素(Wheat Germ Agglutinin,WGA)(Thermo Fisher Scientific)；成纖維細胞因子23(FGF-23) Elisa Kit(Kainos Laboratories)。

主要儀器MSS3小動物麻醉機(任誼生物)；BP2000小動物血壓儀(Visitech Systems)；DXL-D大鼠代謝籠(Asylum Research)；AU680全自動生化分析儀(Beckman Coulter)；Vevo2100高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)(VisualSonics)；DM5000B顯微鏡(Leica Microsystems)。

實驗方法

分組 39只SD大鼠，隨機分為手術(shù)組及假手術(shù)組，手術(shù)組21只、假手術(shù)組18只。

CKD模型制備 適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，手術(shù)組以5%異氟烷誘導(dǎo)麻醉、2%異氟烷維持麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺上。右側(cè)背直肌外側(cè)局部備皮，常規(guī)消毒，無菌操作下切開右背側(cè)皮膚及各層組織，打開腎脂肪囊以暴露右腎，分離腎上腺并固定右腎，腎上、下極均切除大部，切除范圍見圖1A(大約切除一側(cè)腎臟的3/4)，明膠海綿壓迫止血，逐層縫合。術(shù)后1周進行第2次手術(shù)，同法麻醉，切開左側(cè)肋下背直肌外側(cè)皮膚及各層組織以暴露左腎，結(jié)扎腎蒂，切除左腎(注意不要傷及腎上腺)，逐層縫合。假手術(shù)組以同法麻醉后，僅分兩次剝離左腎及右腎脂肪囊，但不切除。術(shù)后飼養(yǎng)于室溫24℃、12h光照、12h黑暗的清潔級動物房中，充足供水和標準飼料喂養(yǎng)。

心臟M型超聲檢測 7/8腎切除后1周、3周和5周進行心臟超聲檢測，觀察心臟的動態(tài)變化。異氟烷麻醉后胸骨區(qū)皮膚備皮，Vevo2100測定左室壁厚度、左室內(nèi)徑、射血分數(shù)、左心室質(zhì)量等指標。

血壓測定 7/8腎切除后1周、3周和5周利用BP2000進行血壓測定，收集收縮壓及舒張壓數(shù)據(jù)。

腎功能及鈣磷代謝指標測定 7/8腎切除第2次手術(shù)后1周、3周和5周將大鼠置于代謝籠24h，收集尿液，麻醉后稱取體重，摘除眼球取血，室溫靜置2h后4 500g，4℃，離心5 min以制備血清。全自動生化分析儀測定尿肌酐、血清肌酐，血清尿素氮，血清鈣，血清磷濃度。并測定血清FGF-23濃度。利用下述公式計算肌酐清除率：

肌酐清除率=(尿液肌酐濃度×每分鐘尿量)/(血清肌酐濃度×體重(g)/100)

心臟重量指數(shù)的測定 7/8腎切除第2次手術(shù)后1周、3周和5周各處死一批大鼠(每次均為假手術(shù)組6只，手術(shù)組5或6只)。麻醉并留取血液后，左心室灌注生理鹽水，洗凈淤血后取出心臟，修剪多余組織并用濾紙吸干其表面水分。稱量心重，計算心重/體重。利用超聲獲得的左心室質(zhì)量，計算左心室重/心重及左心室重/體重。

心臟及腎臟病理 沿垂直于腎臟長軸的方向橫斷腎臟，取部分放入4%中性甲醛中固定，制備石蠟切片，用Masson染色試劑盒染色后200倍鏡下拍照，觀察纖維化情況。心臟放入4%中性甲醛中固定，制備石蠟切片，用HE染色試劑盒染色后8倍鏡下拍照，觀察心肌肥厚情況；用Masson染色試劑盒染色后200倍鏡下拍照，觀察纖維化情況。

心肌肥厚指標的測定 取左心室部分約30mg組織，RNA提取試劑盒提取總RNA?？俁NA進行二步法qPCR，以18S為參比基因?qū)π姆库c尿肽(ANP)及腦尿鈉肽(BNP)進行相對定量。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用Graphpad Prism 8軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組之間差異采用t檢驗或Mann Whitney檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一般情況手術(shù)組第1次手術(shù)后全部存活，第2次手術(shù)后1周內(nèi)共死亡4只，存活率81%。其中2只死亡于術(shù)后第3天，1只死亡于術(shù)后第5天，1只死亡于術(shù)后第6天。假手術(shù)組全部存活。第2次手術(shù)后1、3、5周觀察大鼠(圖1B)，可見假手術(shù)組皮毛致密、整齊而有光澤，反應(yīng)速度正常，進食進水正常；手術(shù)組在7/8 腎切除后1周尚無明顯異常，精神尚可，活動正常，但7/8 腎切除后3周至5周逐漸出現(xiàn)不同程度皮毛蓬松、枯槁無光澤，精神不振，食欲減退。

CKD模型的腎臟表型7/8腎切除后1、3、5周，可見大鼠體重增加緩慢，與假手術(shù)組的差異逐漸

圖1 腎臟切除示意及觀察時間安排A：腎切除范圍示意圖，虛線外為5/6 腎切除切除腎組織范圍，實線外為7/8 腎切除切除腎組織范圍；B：術(shù)后觀察時間及觀察內(nèi)容

增大(圖2A)。手術(shù)組血清肌酐在7/8 腎切除后1周時極度升高、3周時有所降低，但在第5周又出現(xiàn)上升的趨勢(圖2B)。對應(yīng)的肌酐清除率亦出現(xiàn)降低、升高、再降低的趨勢(圖2C)。手術(shù)組血尿素氮則呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(圖2D) 。手術(shù)組出現(xiàn)明顯的高血壓，收縮壓及舒張壓均表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(圖2E、F)。與假手術(shù)組相比，手術(shù)組血清鈣呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，血清磷呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。FGF23作為一重要的鈣磷調(diào)節(jié)分子[8]，亦因高磷血癥而呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(表2)。腎組織Masson染色可發(fā)現(xiàn)，手術(shù)組在7/8 腎切除后1周即有部分腎小管擴張，術(shù)后第3周擴張的腎小管增多，術(shù)后第5周出現(xiàn)明顯的腎間質(zhì)纖維化(圖2G)。上述結(jié)果表明7/8 腎切除后5周，CKD模型構(gòu)建成功。

圖2 慢性腎臟病模型的腎臟表型A：手術(shù)組體重增長緩慢，與假手術(shù)組體重差距逐漸增加；B：手術(shù)組血清肌酐呈現(xiàn)高-低-高趨勢；C：手術(shù)組肌酐清除率呈現(xiàn)低-高-低趨勢；D：手術(shù)組血清尿素氮呈現(xiàn)增高趨勢；E～F：手術(shù)組收縮壓及舒張壓呈現(xiàn)增高趨勢；G：手術(shù)組腎小管擴張并逐漸出現(xiàn)間質(zhì)纖維化；與同周假手術(shù)組比較；**：P<0.01

表2 術(shù)后血清鈣、磷及成纖維細胞生長因子23濃度

*及**均為與同周假手術(shù)組比較；*：P<0.05；**：P<0.01

CKD模型的心臟表型7/8腎切除后1、3、5周進行心臟超聲觀察，可見大鼠在7/8 腎切除后第5周出現(xiàn)明顯的心肌壁厚度增加(圖3A)。M型超聲顯示舒張期室間隔厚度(IVS;d)及舒張期左心室后壁厚度(LVPW;d)均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，并在7/8腎切除后第5周出現(xiàn)明顯的肥厚(圖3C、D)；假手術(shù)組與手術(shù)組間的舒張期左心室內(nèi)徑(LVID;d) 在術(shù)后第5周則未出現(xiàn)明顯差異，提示7/8腎切除后 5周大鼠心臟呈現(xiàn)向心性肥厚(圖3E)。具體超聲數(shù)據(jù)可見表3。與假手術(shù)組相比，手術(shù)組心重/體重、左心室重/心重及左心室重/體重在術(shù)后第5周均有顯著差異(圖3F～H) 。上述結(jié)果表明7/8 腎切除后第5周大鼠出現(xiàn)明顯的左心室向心性肥厚。

圖3 慢性腎臟病模型的心臟表型IVS;d：舒張期室間隔厚度；LVPW;d：舒張期左心室后壁厚度；LVID;d：舒張期左心室內(nèi)徑 A～B：手術(shù)組在7/8腎切除后第5周出現(xiàn)LVH；C～D：手術(shù)組在7/8腎切除后第5周出現(xiàn)的IVS;d及LVPW;d明顯增加；E：手術(shù)組與假手術(shù)組的LVID;d無顯著差別；F～H：手術(shù)組術(shù)后第5周出現(xiàn)心重/體重、左心室重/心重及左心室重/體重顯著增加；*：P<0.05；**：P<0.01

表3 超聲心動圖結(jié)果

IVS;d：舒張期室間隔厚度；LVPW;d：舒張期左心室后壁厚度；LVID;d：舒張期左心室內(nèi)徑 IVS;s：收縮期室間隔厚度；LVPW;s：收縮期左心室后壁厚度；LVID;s：收縮期左心室內(nèi)徑；與同周假手術(shù)組比較；*：P<0.05；**：P<0.01

CKD所致LVH的病理學(xué)性質(zhì)由于7/8 腎切除后第5周大鼠出現(xiàn)明顯的心肌肥厚，因此選擇第5周的大鼠心肌組織進行進一步觀察。心臟橫截面切片觀察顯示明顯的左心室肥厚(圖3B)。WGA染色可見，相較于假手術(shù)組，手術(shù)組出現(xiàn)明顯的心肌細胞橫截面積增加，說明7/8腎切除可直接導(dǎo)致心肌細胞的肥大，這也是心肌肥厚的組織學(xué)基礎(chǔ)(圖4A、B)。Masson染色后觀察切片，假手術(shù)組心肌細胞分布均勻且心肌間質(zhì)無明顯纖維化，而手術(shù)組則出現(xiàn)心肌間質(zhì)膠原沉積、纖維化，心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂(圖4C)。實時定量PCR顯示手術(shù)組心肌組織肥厚指標ANP及BNP出現(xiàn)明顯上調(diào) (圖4D)。上述結(jié)果表明7/8腎切除后第5周大鼠Ⅳ型CRS模型構(gòu)建成功。

圖4 7/8腎切除后第5周大鼠出現(xiàn)病理性LVHANP：心房鈉尿肽；BNP：腦尿納肽；LVH：左心室肥厚；A～B：手術(shù)組在7/8腎切除后第5周出現(xiàn)明顯的心肌細胞橫截面積增加；C：手術(shù)組在7/8腎切除后第5周出現(xiàn)明顯心肌結(jié)構(gòu)紊亂、間質(zhì)纖維化；D：手術(shù)組在7/8腎切除后第5周心肌組織出現(xiàn)明顯的ANP、BNP表達上調(diào)增加；**：P<0.01

討 論

目前認為CKD患者的心血管并發(fā)癥是影響其預(yù)后的重要因素[9]，甚至輕度腎功能異常也可顯著增加心血管疾病的風險[10]。ADQI將慢性原發(fā)性腎臟疾病造成心血管功能異常的CRS劃分為Ⅳ型CRS[1]。Ⅳ型CRS 患者的心肌細胞將不可避免地出現(xiàn)肥大及凋亡，由此導(dǎo)致心肌肥厚、纖維化甚至心力衰竭[11]。Ⅳ型CRS最主要的病理特征是LVH，大約65%的透析前患者出現(xiàn)LVH[12]，透析超過5年的患者幾乎都伴有LVH[13-14]。LVH主要由血液動力學(xué)因素及非血液動力學(xué)因素引發(fā)，而后者又包括神經(jīng)-內(nèi)分泌紊亂、炎癥等[15]。非血液動力學(xué)因素中涉及極為復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而目前對其了解極為有限。為進一步研究Ⅳ型CRS，動物模型的構(gòu)建顯得極為必要。

目前實驗多采用SD大鼠及5/6 腎切除來構(gòu)建Ⅳ型CRS模型，然而模型構(gòu)建時間、是否需要其他輔助成模手段均無一致定論。不同研究組給出的成模時間均有不同，如術(shù)后2周[5]、4周[7]或5周[16]均有報道模型成功。一些研究人員術(shù)后采用高磷飼料喂養(yǎng)[17]，但也有采用標準飼料喂養(yǎng)[18]，卻同樣可出現(xiàn)LVH。我們在預(yù)實驗時制作了SD大鼠5/6腎切除 CKD模型，發(fā)現(xiàn)5/6 腎切除后第5周直至第10周，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組雖然出現(xiàn)血清肌酐升高，左心室心肌肥厚的形態(tài)學(xué)指標(心臟超聲及左心室重/體重)并未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(數(shù)據(jù)未顯示)。這些均說明5/6腎切除法制備Ⅳ型CRS模型的可靠性較低。

最近，Shi等[19]利用129SV小鼠采取一次性順鉑腹腔注射配合高磷飲食成功地構(gòu)建了急性腎損傷(AKI)-CKD模型，并在造模后20周觀察到了明顯的心肌肥厚。該造模方法較為簡便，且存活率在80%以上，然而此法是否可用于大鼠仍不清楚，因此我們?nèi)匀贿x擇腎切除制備大鼠Ⅳ型CRS模型。5/6 腎切除法制備Ⅳ型CRS模型的可靠性較低，是否可通過增加腎組織切除量加重腎損傷，最終制備穩(wěn)定的Ⅳ型CRS模型？

7/8腎切除后，大鼠死亡集中于術(shù)后3天到第7天，提示手術(shù)并發(fā)癥(如出血、麻醉過深等)致死的可能性較低，腎切除所致急性腎損傷可能是大鼠死亡的主要原因。7/8腎切除的死亡也與術(shù)者操作水平有關(guān)，因此改善手術(shù)環(huán)境、提高操作水平等可能會進一步提升7/8腎切除大鼠的存活率。7/8腎切除后，手術(shù)組腎單位數(shù)目大幅度降低，出現(xiàn)血尿素氮和血清肌酐明顯升高，肌酐清除率降低，并伴有高血壓、高磷血癥、一定程度的低血鈣及高FGF-23血癥，其中高FGF-23血癥常由腎功能受損后導(dǎo)致的鈣磷代謝紊亂所致，并可直接導(dǎo)致LVH[5]，上述結(jié)果表明CKD模型構(gòu)建成功。同時，手術(shù)組在7/8腎切除后5周心肌壁厚度、心重/體重、左心室重/心重及左心室重/體重均出現(xiàn)顯著增高，同時出現(xiàn)心肌細胞肥大、心肌間質(zhì)纖維化及肥厚指標ANP、BNP表達上調(diào)。因此，7/8腎切除后5周手術(shù)組不僅可出現(xiàn)明顯CKD表現(xiàn)，尚伴有明顯的心肌肥厚，表明Ⅳ型CRS構(gòu)建成功。

綜上所述，大鼠7/8腎切除能在無需高磷飼料喂養(yǎng)的情況下在較短時間內(nèi)形成穩(wěn)定的Ⅳ型CRS模型，這對Ⅳ型CRS的機制研究及藥物開發(fā)均有重要意義。