胡 浩，蔡江雄，林 然，江靈莉

0 引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者晚期的并發(fā)癥之一，是導致患者視力下降的重要原因[1-2]。糖尿病患者的高血糖導致氧化應(yīng)激、炎癥、血管通透性和視網(wǎng)膜神經(jīng)變性，最終出現(xiàn)DR[3-5]。DR演變一般經(jīng)歷兩個階段：早期非增殖階段(NPDR)和晚期增殖階段(PDR)[2]。NPDR階段特點是各炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子α(TNF-α)，核因子κB(NF-κB)和細胞間粘黏附分子-1(ICAM-1)在視網(wǎng)膜上的產(chǎn)生增加[6]，持續(xù)的缺氧和產(chǎn)生這些炎癥介質(zhì)使其發(fā)展到PDR階段。PDR的特點是分泌血管生成介質(zhì)增強，包括低氧誘導因子-1α(HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的增加，血視網(wǎng)膜屏障的破壞和微血管叢在視網(wǎng)膜毛細血管的形成[7-8]。炎癥和血管生成介質(zhì)的產(chǎn)生導致視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞的應(yīng)激反應(yīng)，其特征是增強膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的產(chǎn)生，光感受器細胞功能損傷或光感受器細胞凋亡，最終導致失明[8-9]。因此，DR引起視網(wǎng)膜組織的結(jié)構(gòu)和功能異常，需要治療干預(yù)控制疾病進展。

有研究表明，聚合物納米粒(NPs)由于其緩釋作用，能夠提供持續(xù)幾天甚至幾個月的藥物分子供給[10]。由于高表面積與體積比，這些傳遞系統(tǒng)通過細胞內(nèi)吞機制很容易被細胞內(nèi)吞，同時也促進藥物通過緊密的細胞連接運輸[11]。此外，聚合物NPs的組成控制著粒子-組織的相互作用，而粒子組織的相互作用又控制著藥物在眼睛局部的時空分布[12]，眼組織層對親水性和疏水性分子具有不同的滲透性[13]。我們假設(shè)通過設(shè)計納米輸送系統(tǒng)，由于其表面親水性/疏水性可優(yōu)先與眼層組織相互作用和發(fā)生滲透，從而提高視網(wǎng)膜的藥物生物利用度[12]。此外，通過生理屏障的抵抗清除，NPs的大小也決定了局部給藥藥物的視網(wǎng)膜生物利用度[14]。因此，本研究制備一種基于PCL和PF68形成核殼結(jié)構(gòu)的納米粒輸送系統(tǒng)，包括一個疏水聚已酸內(nèi)酯核和親水普朗尼克?F68殼來裝載用于包載曲安奈德(TA)，評價其在糖尿病(DR)大鼠模型中的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料 聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乙丙交酯(PLGA)、聚乳酸(PLA)、pluronic?F-68(PF68)、殼聚糖(CHI)、明膠(GEL)、聚乙烯醇(PVA)、多聚賴氨酸(poly-L-lysine)、鏈脲佐菌素(STZ)購自阿拉丁；曲安奈德(TA)藥購自天津市金匯藥業(yè)有限公司；胎牛血清購自Thermo scientific。

1.2 NPBs、NPDs的制備 將0.25%(w/w)的PF68 作為水相、0.5%(w/w)的PCL和0.05%(w/w)TA丙酮溶液作為有機相，水相與有機相以2∶1(v/v)比例混合并充分攪拌。制備NPBs時，不加TA，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司)在低壓下蒸發(fā)有機溶劑。所形成的膠體懸浮液經(jīng)過夜攪拌去除殘留有機溶劑。然后用去離子水重懸，離心分離NPs，最后用凍干法制得NPBs或NPDs。

1.3 PCL-PF68 NPs的形態(tài)學特征、尺寸和Zeta電位 利用掃描電子顯微鏡(EVO 18)對其表面形貌進行表征(SEM)，放大60 000倍和100 000倍觀察。采用馬爾文激光粒度儀(Zetasizer，Nano ZS90)確定NPBs和NPDs的粒徑大小。用于NPs分散的介質(zhì)是DI水。采用激光多普勒測速與相位分析光散射相結(jié)合的方法確定NPs的ζ電位。

1.4 NPs的包載效率和藥物負載 為了評估載藥NPs的包封效率，將其分別溶于氯仿，在238 nm處用紫外-可見分光光度計記錄各自溶液的吸光度。將TA在氯仿中溶解(10～80 μg/ml)繪制的標準曲線來確定。藥物負載和包封率的計算公式如下：

1.5 TA裝載PCL-PF68 NPs的藥物釋放動力學 評估在PBS(pH=7.4)中 PCL-PF68 NPs中TA的體外釋放動力學。NPDs懸浮于PBS(0.05%，w/v)并放入透析袋(10 kDa)，置于15 ml的PBS透析介質(zhì)中，溫度37 ℃。在指定時間點從PBS中取1 ml樣品，用紫外分光光度法測定TA濃度。取樣后，等量的PBS緩沖液添加以補充介質(zhì)。用NPs釋放的TA濃度表示累積釋放，繪制出時間函數(shù)。

1.6 PCL-PF68 NPs體外細胞相容性研究 采用角膜上皮細胞系(SIRC)進行NPBs和NPDs的細胞相容性研究。檢測不同濃度的NPs(0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml)確認急性和慢性毒性。將細胞(含有10%FBS的DMEM中培養(yǎng))以3.5×105個細胞/孔的密度接種在96孔板中，于37 ℃下、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h，加入NPs，再孵育24 h以獲得急性毒性，并在進行MTT測定之前將其孵育72 h，以獲得慢性毒性。MTT法測定吸光度為560 nm，背景吸光度為690 nm。未處理的細胞作為有100%存活率的陽性對照，未添加試驗試劑的細胞作為空白對照。相對細胞存活率的計算公式如下(數(shù)據(jù)取3次測量的平均值)：

1.7 DR大鼠模型的建立及分組 雄性Sprague Dawley大鼠，體重(230±14)g，3個月，獲自溫州醫(yī)科大學動物實驗中心，飼養(yǎng)條件為溫度(22±2)℃，相對濕度50%，光照/黑暗周期12 h。對照組大鼠以0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)作為載體，實驗組大鼠單次腹膜內(nèi)注射35 mg/kg STZ(0.1 mmol/L pH 4.5檸檬酸鈉緩沖液配制成1% STZ溶液)。STZ注射72 h后通過監(jiān)測空腹血糖水平>120 mg/d為造模成功。對照組和糖尿病動物均正常飲食，每周記錄每只動物的體重和血糖濃度，每周2次向血糖濃度≥350 mg/dl的糖尿病大鼠腹腔注射胰島素。在10周結(jié)束時，將動物隨機分成2組(2個時間點：20 d、40 d)。將這些不同時間點的組分成3個亞組：亞組-Ⅰ[糖尿病大鼠對照組-左眼提供PBS(PBS)，右眼在PBS(D)基礎(chǔ)上提供TA]，亞組-Ⅱ糖尿病大鼠實驗組-左眼提供安慰劑NPs(NPB)，右眼提供TA負載的NPs(NPD)]，亞組-Ⅲ[非糖尿病大鼠對照組-左眼和右眼均提供PBS作為滴眼液(對照)]。每天2次應(yīng)用大約25 μl的滴眼劑(早6∶00和晚17∶00)。治療持續(xù)20、40 d，在兩個不同時間點(第21天和第41天)處死大鼠，并將眼球用于組織病理學分析。

1.8 組織病理學分析 在大鼠安樂死之后，將眼球摘出并用于組織病理學分析。將眼球摘出并切成兩個半球以除去晶狀體和玻璃體液，并置于4%多聚甲醛(PFA)中，固定48 h，包埋在石蠟塊中并切片。將切片脫石蠟并在乙醇溶液(100%、95%、70%乙醇)的梯度中水合。視神經(jīng)頭的矢狀面取向的中央部分用于測量。切片用蘇木精-伊紅進行HE染色，并使用顯微鏡捕獲圖像。此外，通過image J軟件確定所有亞組的視網(wǎng)膜層的厚度之和。

2 結(jié)果

2.1 空白PCL-PF68的制備和表征 使用納米沉淀法成功制備了NPBs和NPDs。NPs的SEM成像表明NPs呈球形，具有光滑的形態(tài)(圖1A、1B)。納米粒徑測定儀測定結(jié)果顯示，NPB和NPD的平均流體動力學直徑分別為(163±4)nm和(184±2)nm(圖1C)，尺寸均勻，多分散性低。NPBs和NPDs的ζ電位分別為(-21±5)mV和(-13±1)mV(圖1D)。

2.2 NPs的載藥量 NPDs的包封率為60%，載藥量為(60±5)μg/mg。

2.3 TA負載的PCL-PF68 NPs藥物釋放動力學 藥物釋放動力學結(jié)果顯示，在最初的7 d內(nèi)，釋放了約60%的藥物，然后在接下來的18 d內(nèi)持續(xù)釋放(圖2A)。初始釋放后持續(xù)釋放，在20 d內(nèi)釋放80%的藥物。

圖1 TA負載(NPD)和空白(NPB)PCL-PF68 NPs的表征

圖2 TA負載(NPD)的藥物釋放及細胞相容性

2.4 PCL-PF68 NPs體外細胞相容性研究 在24 h 暴露的試驗濃度下，NPBs、NPDs的細胞存活率均為100%，表明NPBs和NPDs的細胞相容性(圖2B)。與NPBs孵育72 h后，細胞活力超過100%，而NPDs細胞活力為92%±8%。見圖2C。

2.5 組織病理學分析 不同滴眼液治療后，觀察視網(wǎng)膜組織病理。HE染色的視網(wǎng)膜圖像顯示，滴眼治療20 d后，各治療組的視網(wǎng)膜層厚度比較差異無統(tǒng)計學意義(圖3A、圖3B)。然而，治療40 d后，與糖尿病組(PBS、NPB和游離藥物)相比，非糖尿病對照組和NPD治療的眼睛顯示出更厚的視網(wǎng)膜層(圖3A、圖3C)。此外，NPD處理組和非糖尿病對照組動物眼睛的厚度相當。

3 討論

DR已成為我國4大致盲眼病之一。TA作為一種非水溶性的糖皮質(zhì)激素，具有強大的抗炎作用，其用于治療DR主要是能夠降低炎癥血管的滲透性，穩(wěn)定血眼屏障[15]。但是由于眼部特有的解剖結(jié)構(gòu)，常規(guī)眼部制劑一般很難達到視網(wǎng)膜發(fā)揮作用，用藥受到限制[16]。具有控釋性的納米粒子在眼部視網(wǎng)膜疾病中比常規(guī)治療的效果更好，能保持有效的藥物治療濃度，有效抑制新生血管，且對眼組織無毒性作用[17-19]。

為此，我們通過設(shè)計納米輸送系統(tǒng)，提高視網(wǎng)膜的藥物生物利用度[12]。本研究使用PCL和PF68形成核殼結(jié)構(gòu)的納米粒輸送系統(tǒng)用于包載TA，成功制備了球形NPBs和光滑形態(tài)的NPDs，結(jié)果表明，兩親性PF68分子在制備過程中穩(wěn)定了疏水性PCL NPs。PF68的穩(wěn)定作用可能是由于PF68中存在PPO和PEO單元。PPO單元與疏水性PCL鏈相互作用并使PEO鏈可與水相互作用，以形成穩(wěn)定的核-殼NPs[20]。此外，NPDs的Zeta電位略有正向變化，可能是由于NPs表面存在中性TA分子。同樣，PCL核心的疏水性質(zhì)為疏水性藥物TA提供了最佳包封效率，這可歸因于PCL和TA之間的疏水相互作用。

藥物的初始釋放是由NPDs表面吸附藥物引起的。研究表明，藥物的持續(xù)釋放是由于PCL在水介質(zhì)中的降解速度較慢導致膠囊藥物的緩慢釋放[10]。我們的研究結(jié)果與降解動力學數(shù)據(jù)一致，表明在初始時間點，NPs的降解速度較慢。推測聚合物降解導致水分子滲透到NPs的大部分中，進而導致藥物溶解和擴散。

由于NPDs的最終應(yīng)用涉及與眼組織接觸，因此，其所需的濃度應(yīng)顯示治療效果，同時提供最小或無細胞毒性作用。因此，通過將其以遞增濃度暴露于SIRC細胞系的2個持續(xù)時間，24 h(急性細胞毒性)和72 h(慢性細胞毒性)來研究NPs的細胞相容性。本研究結(jié)果顯示，NPBs暴露72 h后的存活率較高，可能是由于納米粒誘導的氧化應(yīng)激導致細胞在與NPBs孵育時增殖增強所致[21]。此外，NPDs孵育后細胞活力下降(雖然不明顯)，可以歸因于TA的抗增殖作用[22]。組織病理學結(jié)果表明，用NPDs處理改善了視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的完整性。這可能是由于藥物輸送系統(tǒng)在視網(wǎng)膜上呈現(xiàn)更高濃度的TA，會減少炎癥、VEGF分泌和內(nèi)皮細胞增殖，從而提高治療效果。

圖3 不同滴眼劑處理20、40 d后大鼠視網(wǎng)膜的組織病理學分析

4 結(jié)論

綜上所述，TA負載的PCL-PF68核-殼納米粒在作為滴眼劑施用時將TA遞送至視網(wǎng)膜，這是向眼組織施用藥物的無創(chuàng)且安全的模式，其避免了與玻璃體內(nèi)注射相關(guān)的缺點。這種將TA以治療濃度傳輸?shù)揭暰W(wǎng)膜的能力不僅能減少炎癥，還能改善DR大鼠視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能活性。因此，TA負載的PCL-PF68核-殼納米?？捎糜诖笫驞R的無創(chuàng)性治療，并且可以在諸如靈長類動物的高等動物中進一步評估后外推至人類。因此，本研究表明，基于聚合物納米粒的滴眼劑制劑有可能被開發(fā)為用于治療多種視網(wǎng)膜疾病的平臺技術(shù)。