米 超，楊欣欣，齊志鵬，吳鳳迪，崔東日，鄧 宇*

0 引言

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一種進行性、病因不明的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要發(fā)病人群為65歲以上的中老年人，臨床表現(xiàn)以靜止性震顫、肌肉強直、運動遲緩、姿勢步態(tài)異常等運動功能癥狀及睡眠障礙、精神障礙、感覺障礙等自主神經(jīng)功能障礙等癥狀為主要特征[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，世界范圍內(nèi)PD的患病率為0.3%[2]，其中65歲以上年齡段人群占1%～2%，85歲以上年齡段人群患病率增加到3%～5%[3]。有研究顯示，谷氨酸(Glutamate，Glu)的興奮性毒性會加速PD的病理進展。散發(fā)性PD患者表現(xiàn)為Glu攝取量降低，而且其降低程度與PD的嚴(yán)重程度相關(guān)[4]。有研究顯示，Glu的代謝轉(zhuǎn)運障礙與谷氨酸轉(zhuǎn)運體(Excitatory amino acid transporters,EAATs)有密切關(guān)系，EAATs可清除谷氨酸的堆積，進而發(fā)揮保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受Glu興奮性毒性的作用[5]。EAAT1和EAAT2主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞，是Na+/K+依賴的膜蛋白，可促進Glu能突觸周圍的Glu代謝平衡[6]。

利魯唑?qū)儆诒洁邕蝾惢衔铮悄壳坝糜谥委熂∥s性側(cè)索硬化癥的藥物，已有文獻證實其可抑制Glu從神經(jīng)末梢釋放，促進Glu與谷氨酸轉(zhuǎn)運體的結(jié)合[7-9]。早在2002年就有利魯唑治療帕金森的隨機對照試驗，但是未見關(guān)于利魯唑?qū)D的神經(jīng)保護作用的報道[10]。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)能夠造成小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元表達減少，并且出現(xiàn)類似人類的運動功能障礙等現(xiàn)象，是制備PD模型的常用方法[11-12]。本研究主要使用MPTP建立小鼠PD模型后，給予利魯唑干預(yù)，觀察小鼠行為學(xué)變化情況，以及小鼠紋狀體Glu含量、EAAT1及EAAT2蛋白表達、mRNA表達情況，旨在為臨床應(yīng)用利魯唑治療帕金森病提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器 利魯唑和MPTP購自美國Sigma公司，Glu檢測試劑盒來自南京建成生物科技有限公司，鼠抗EAAT1、EAAT2及β-actin抗體來自Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG、Western blot相關(guān)試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及電泳液、RIPA buffer裂解液來自上海碧云天生物技術(shù)研究所。GDS-8000電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(美國UVP公司)，1680酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)，VE-180垂直電泳槽(上海天能科技有限公司)，EPS-300電泳儀和VE-186轉(zhuǎn)印電泳槽(上海天能科技有限公司),722型分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司),WD-9405B型水平搖床(北京市六一儀器廠)。

1.2 實驗動物及分組 健康SPF級昆明小鼠36只，雌雄各半，體重(30±2)g。由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK2013-0001。本實驗經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷，符合衛(wèi)生部實驗動物管理與使用準(zhǔn)則。實驗動物可自由攝食飲水，飼料由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物房室溫18～23 ℃，相對濕度為45%～55%。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將動物隨機分為3組，每組12只，雌雄各半，分別為：①對照組，②MPTP組(PD模型組)，③MPTP+利魯唑組(利魯唑治療組)。注射藥品均以0.9% NaCl作為溶劑配制，各組均以腹腔注射的方式給予5 ml/kg的藥品體積。給予對照組腹腔注射生理鹽水，MPTP組和MPTP+利魯唑組小鼠均腹腔注射25 mg/kg MPTP。2 h后，對照組及MPTP組腹腔注射生理鹽水，MPTP+利魯唑組腹腔注射0.7 mg/kg利魯唑。各組小鼠連續(xù)處理2周。

1.3 行為學(xué)檢測 轉(zhuǎn)棒實驗用于測試小鼠的運動協(xié)調(diào)能力。測試前對每只小鼠進行3次適應(yīng)性轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練，每次訓(xùn)練時長為3 min。將小鼠置于電動轉(zhuǎn)棒上，轉(zhuǎn)棒直徑為2.5 cm，表面為橡膠質(zhì)地，轉(zhuǎn)速為10 r/min，記錄小鼠被置于轉(zhuǎn)棒上至跌落的時間。每只小鼠重復(fù)測定3次，每次間隔30 min，重復(fù)測量3次結(jié)果，取其平均值。

疲勞儀實驗用于檢測小鼠運動耐力。測試前對每只小鼠進行3次適應(yīng)性訓(xùn)練，時間長約 5 min。將小鼠置于疲勞儀轉(zhuǎn)輪甬道中，通電后小鼠若不運動則會被底部電極刺激，記錄小鼠被置于疲勞儀內(nèi)致疲勞致不動時的時間(min)及奔跑距離(m)。每只小鼠重復(fù)測量3次取平均值。

1.4 小鼠紋狀體組織勻漿內(nèi)Glu含量的測定 各組取6只小鼠，分離紋狀體，將部分組織制備成10%的組織勻漿，其余組織備用。使用南京建成試劑盒，根據(jù)Glu+NAD++H2O→α-oxoglutarate+NADH+NH4+的原理測定Glu含量。

1.5 Real-time RT-PCR檢測小鼠黑質(zhì)紋狀體組織EAAT1、EAAT2的mRNA表達 根據(jù)說明書，使用Trizol法提取總RNA，樣品質(zhì)量檢測結(jié)果260 nm/280 nm應(yīng)為1.8～2.0。將提取的總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟反轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后進行熒光定量PCR，采用的反應(yīng)體系為20 μl，其中，SYBR 10 μl、上下游引物各 1 μl、RNA free H2O 6 μl、cDNA 模板 2 μl。合成小鼠EAAT1、EAAT2及GAPDH的引物序列如表1所示。反應(yīng)程序設(shè)定為：95 ℃ 預(yù)變性 30 s，95 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 退火30 s，40個循環(huán)。每次試驗均設(shè)置GAPDH為內(nèi)參。用 2-ΔΔCt法計算各組小鼠黑質(zhì)紋狀體組織EAAT1、EAAT2的mRNA表達的相對表達量。

表1 引物序列

1.6 Western blot檢測小鼠黑質(zhì)紋狀體組織EAAT1、EAAT2的蛋白表達 各組小鼠取3只，分離紋狀體，加入強效RIPA buffer裂解液(Ripa buffer∶PMSF=100∶1)，在冰上使用組織勻漿破碎機裂解成組織勻漿，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，使用BCA試劑盒測蛋白濃度，并將組織蛋白濃度定量到4 μg/μl。將40 μg蛋白樣品與loading buffer緩沖液混勻，進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%BSA封閉液室溫封閉1 h。4 ℃過夜孵育一抗EAAT1(1∶2 000)，EAAT2(1∶2 000)，β-actin(1∶ 3000)，TBST洗膜，HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光顯影，每只小鼠每項指標(biāo)重復(fù)測量3次。使用Image J軟件分析條帶光密度。

2 結(jié)果

2.1 利魯唑?qū)PTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠運動能力障礙的影響 如表2所示，與對照組相比，MPTP處理后，小鼠的轉(zhuǎn)棒潛伏期、耐力潛伏期、跑步距離均縮短(P<0.05)。給予利魯唑干預(yù)后，與MPTP組比較，轉(zhuǎn)棒潛伏期、耐力潛伏期和跑步距離均延長(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。

2.2 利魯唑?qū)PTP致小鼠紋狀體Glu含量增加的影響 與對照組紋狀體內(nèi)Glu(23.55±5.21)μmol/g pro相比，MPTP處理組小鼠紋狀體內(nèi)Glu含量升高，可達(45.62±3.25)μmol/g pro(P<0.01)。給予利魯唑治療后，Glu含量與MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠相比顯著下降，低至(38.36±8.54)μmol/g pro(P<0.01)。此部分每組6只。

2.3 利魯唑?qū)PTP致小鼠紋狀體EAAT1、EAAT2表達下降的影響 應(yīng)用RT-PCR方法，對紋狀體內(nèi)EAAT1、EAAT2的mRNA表達變化進行觀察。如圖1A所示，與對照組相比，MPTP組的小鼠紋狀體內(nèi)EAAT1的mRNA水平降低(P<0.01)；與MPTP組相比，利魯唑干預(yù)后EAAT1的mRNA水平升高(P<0.01)。如圖1B所示，MPTP組的小鼠紋狀體EAAT2的mRNA水平較對照組降低(P<0.01)，而給予利魯唑治療后，與MPTP組相比，EAAT2的mRNA水平明顯回升(P<0.01)。

2.4 利魯唑?qū)PTP致小鼠紋狀體EAAT1和EAAT2表達下降的影響 應(yīng)用Western blot方法，對紋狀體內(nèi)EAAT1、EAAT2的蛋白水平變化進行觀察。如圖2所示，將檢測到的EAAT1及EAAT2的蛋白條帶進行灰度分析，目的蛋白的灰度水平與相應(yīng)內(nèi)參β-actin灰度值用比值表示。如圖2A所示，與對照組相比，MPTP組小鼠的EAAT1蛋白水平顯著降低(P<0.01)。而與MPTP組相比，在利魯唑治療組中，EAAT1蛋白水平顯著回升(P<0.01)。如圖2B所示，MPTP組EAAT2蛋白水平顯著降低(P<0.01)，與MPTP組相比，給予利魯唑治療后，EAAT2水平顯著升高(P<0.01)。

表2 利魯唑?qū)PTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠運動能力的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，* *P<0.01；與MPTP組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖1 各組小鼠紋狀體內(nèi)EAAT1及EAAT2的mRNA水平變化(n=3)

圖2 各組小鼠紋狀體內(nèi)EAAT1及EAAT2的蛋白水平變化(n=3)

3 討論

隨著我國老齡化程度的加劇，PD的患病率急劇增長，并維持在較高水平[13]。Glu的過量堆積是PD發(fā)病機制中的一個重要環(huán)節(jié)，與PD發(fā)病密切相關(guān)。其中，EAATs轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)的功能失調(diào)是很多PD患者共同的特征[14]。很多針對Glu轉(zhuǎn)運體調(diào)節(jié)的分子都顯示出對于神經(jīng)退行性病變的治療作用，如頭孢曲松、埃他卡林等[15-16]，更重要的是，上調(diào)Glu轉(zhuǎn)運體也能抑制α-突觸核蛋白、tau蛋白及β-淀粉樣蛋白的非正常堆積[17-18]。利魯唑?qū)儆诒洁邕蝾惢衔?，有明確的神經(jīng)保護及抗驚厥等藥理作用，然而，應(yīng)用其干預(yù)興奮性Glu轉(zhuǎn)運體進而調(diào)節(jié)PD病理進程的研究很少。Glu轉(zhuǎn)運體是Na+/K+依賴的，而利魯唑可穩(wěn)定Na+通道，抑制Glu的釋放，增強Glu轉(zhuǎn)運體和Glu的結(jié)合力，能有效減少Glu在細(xì)胞外的濃度[8-9]。因此，推測利魯唑可能會對MPTP導(dǎo)致的PD模型鼠的Glu代謝轉(zhuǎn)運障礙起到一定的保護作用。

EAAT1、EAAT2是主要表達在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的Glu轉(zhuǎn)運體，主要任務(wù)是清除細(xì)胞外的Glu。本實驗通過連續(xù)給予昆明小鼠注射25 mg/kg 的MPTP，共7 d，建立PD模型鼠，并給予0.7 mg/kg利魯唑，以建立利魯唑干預(yù)模型。通過轉(zhuǎn)棒實驗及疲勞儀實驗檢測小鼠的行為學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)MPTP處理組的小鼠的耐力時間與奔跑距離均較對照組縮短，說明造模成功，經(jīng)過MPTP處理過的小鼠均達到PD患病程度。而經(jīng)過利魯唑干預(yù)后的小鼠以上運動行為學(xué)指標(biāo)都有不同程度的提升，說明利魯唑?qū)τ赑D患病小鼠確實具有顯著的改善作用。MPTP組小鼠Glu水平顯著高于對照組，說明PD小鼠的紋狀體區(qū)發(fā)生了Glu的過量堆積或者代謝異常。而利魯唑可能會對Glu重攝取有促進作用。為分析其原因，本研究進一步檢測了紋狀體EAAT1、EAAT2蛋白及mRNA 表達，結(jié)果顯示，MPTP組小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)的EAAT1、EAAT2的蛋白及mRNA水平均下降，而利魯唑治療后，這兩種轉(zhuǎn)運體的蛋白及mRNA水平較MPTP組相比顯著回升，說明利魯唑?qū)τ赑D模型鼠的Glu代謝轉(zhuǎn)運障礙具有保護作用。

1996年即有研究者報道，利魯唑在帕金森疾病模型鼠中具有保護性作用，利魯唑降低了阿撲嗎啡誘導(dǎo)的對側(cè)旋轉(zhuǎn)和苯丙胺誘導(dǎo)的同側(cè)旋轉(zhuǎn)，也可以減輕6-羥基多巴胺引起的黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元病變[19]。在2000年，Boireau等[20]檢測了給予小鼠注射MPTP后，利魯唑?qū)π∈蠹y狀體內(nèi)MPP(+)形成和積累的影響，發(fā)現(xiàn)利魯唑并沒有影響MPP(+)的積累，說明利魯唑?qū)PTP毒性的保護作用并不是因為影響了MPTP在體內(nèi)的代謝。Obinu等[21]通過給予帕金森病絨猴利魯唑治療后，發(fā)現(xiàn)利魯唑治療的絨猴保持了更好的運動功能和神經(jīng)功能。利魯唑可以保護多巴胺能神經(jīng)元，并減少帕金森病模型中的行為缺陷。但是，目前關(guān)于利魯唑?qū)ε两鹕Ｐ捅Ｗo的具體機制的研究甚少，本研究著眼于機制學(xué)，證實了利魯唑的神經(jīng)保護功能，也發(fā)現(xiàn)了利魯唑可通過EAAT1、EAAT2促進Glu的重新攝取，從而發(fā)揮PD保護作用。

綜上所述，本研究重新探索了利魯唑的其他治療應(yīng)用，從帕金森病的發(fā)病機制-紋狀體區(qū)的Glu代謝轉(zhuǎn)運異常出發(fā)，發(fā)現(xiàn)利魯唑?qū)D小鼠紋狀體區(qū)Glu過量堆積以及轉(zhuǎn)運異常具有抑制作用，并認(rèn)為通過保護EAAT1、EAAT2的數(shù)量及功能可以產(chǎn)生神經(jīng)保護作用，在一定程度上為臨床應(yīng)用利魯唑治療帕金森病提供實驗理論依據(jù)。