陳生曉，林曉明，甘艷，高飛，尹紀來

(1中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第928醫(yī)院，海口571159；2海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

膜性腎病是臨床上腎病綜合癥的主要類型，病理特征為大量免疫復(fù)合物在腎小球基底膜上皮細胞下彌漫、沉積，造成基底膜增厚[1]。膜性腎病根據(jù)病因可分為特發(fā)性膜性腎病(IMN)和繼發(fā)性膜性腎病(SMN)兩種。IMN指與抗磷脂酶A2受體抗體相關(guān)的膜性腎病，占膜性腎病總數(shù)的80%；SMN大多由自身免疫性疾病、乙型肝炎病毒(HBV)感染、藥物、腫瘤等明確病因所引起[2，3]。足細胞分布于腎小球基底膜外側(cè)，與腎小球基膜、血管內(nèi)皮細胞共同組成血液濾過屏障。足細胞損傷、缺失與膜性腎病患者蛋白尿的發(fā)生及腎小球硬化密切相關(guān)，而自噬參與了該過程[4]。自噬是真核生物特有的保護機制，可消化并循環(huán)利用大分子物質(zhì)、受損細胞器等，為維持腎小球及腎小管穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵機制。研究發(fā)現(xiàn)，膜性腎病、糖尿病腎病、腎組織缺血再灌注損傷等病理過程均與自噬有關(guān)[5，6]，但自噬在腎病進展中的作用尚不清楚。本研究觀察了IMN和SMN足細胞中自噬體數(shù)量及自噬蛋白Beclin-1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)表達變化，探討足細胞自噬與膜性腎病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年9月～2017年10月于本院經(jīng)腎穿刺活檢確診為膜性腎病且有透射電鏡檢查結(jié)果的患者114例，留取活檢病灶組織標本。其中IMN患者92例(IMN組)，男56例、女36例，年齡(48.13±11.72)歲，合并水腫66例、鏡下血尿64例、腎病綜合征62例；SMN患者22例(SMN組)，男7例、女15例，年齡(30.08±9.26)歲，合并水腫16例、鏡下血尿19例、腎病綜合征13例。SMN患者包括狼瘡腎炎Ⅴ型16例、HBV感染相關(guān)腎炎3例、不典型膜性腎病3例。IMN組、SMN組患者均行腎活檢術(shù)，并用光鏡、免疫熒光、電鏡行常規(guī)腎臟病理學(xué)檢查。另選擇因外傷、輸尿管腫瘤等其他原因行腎切除手術(shù)的患者30例為對照組，術(shù)中留取正常腎組織標本。對照組中，男17例、女13例，年齡(36.25±3.16)歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準進行，標本采集符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》。三組性別、年齡、24 h尿蛋白量(24 h UP)、尿酸(UA)、白蛋白(Alb)、血肌酐(Scr)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，其余指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 三組24 h UP、UA、估算腎小球濾過率(eGFR)、總蛋白(TP)、Alb、Scr、尿素氮(BUN)水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

1.2 足細胞自噬體觀察及計數(shù) 腎臟活檢組織用10%甲醛固定，石蠟包埋。組織蠟塊預(yù)冷后以4 μm厚度行連續(xù)切片，每個蠟塊制備5～7張切片，于60 ℃條件下烤片2 h。切片用二甲苯脫蠟、不同濃度的乙醇水化；蘇木素染色5～10 s，水沖洗；1%鹽酸乙醇分化5～10 s，水沖洗；伊紅溶液染色1～2 min；常規(guī)脫水透明；中性樹膠封片；在光鏡下觀察。取1 mm3大小的腎皮質(zhì)浸入含2.5 %戊二醛、2 %多聚甲醛的磷酸緩沖液中，固定2 h；PBS沖洗；梯度乙醇、丙酮脫水；丙酮包埋液包埋；依次置于37、45、60 ℃烘箱中固化；以50～60 nm厚度超薄切片；在透射電鏡下觀察并拍照。每例患者選擇5～7個足細胞進行觀察，記錄足細胞胞質(zhì)內(nèi)自噬體數(shù)量，取均數(shù)。

1.3 腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白檢測 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化；胰酶修復(fù)抗原；浸入5%山羊血清中，37 ℃孵育20 min；浸入LC3或Beclin-1兔抗多克隆抗體(1∶100)稀釋液中，37 ℃過夜；浸入FITC標記的羊抗兔抗體(1∶200)稀釋液中，4 ℃孵育2 h；PBS漂洗，甘油封片，放入濕盒，于4 ℃避光保存。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image Pro plus分析各切片的熒光強度，表示目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組足細胞自噬體數(shù)量比較 IMN組、SMN組、對照組足細胞自噬體數(shù)量分別為(2.63±0.94)、(2.58±0.52)、(3.22±0.86)個，IMN組和SMN組足細胞自噬體數(shù)量較對照組減少(P均<0.05)。

2.2 足細胞自噬體數(shù)量與膜性腎病臨床病理參數(shù)的關(guān)系 IMN組、SMN組中，臨床分期為Ⅱ期、24 h UP≥3.5 g/L、Alb≥30 g/L、eGFR≥60 mL/(min·1.73 m2)的患者足細胞自噬體數(shù)量分別少于臨床分期為Ⅰ期、24 h UP<3.5 g/L、Alb<30 g/L、eGFR<60 mL/(min·1.73 m2)的患者(P均<0.05)。詳見表2。IMN組、SMN組足細胞自噬體數(shù)量與24 h UP(r分別為0.172、0.154)、eGFR(r分別為-0.168、-0.182)、Scr(r分別為0.317、0.302)、BUN(r分別為-0.192、-0.171)均無相關(guān)性(P均>0.05)。

表2 足細胞自噬體數(shù)量與膜性腎病臨床病理參數(shù)的關(guān)系(個，

注：與Ⅰ期患者相比，*P<0.05；與24 h UP<3.5 g/L者相比，#P<0.05；與Alb<30 g/L者相比，△P<0.05；與eGFR<60 mL/(min·1.73 m2)者相比，☆P<0.05。

2.3 各組腎組織中自噬相關(guān)蛋白表達比較 IMN組和SMN組腎組織中LC3、Beclin-1相對表達量低于對照組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組腎組織中LC3、Beclin-1相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

膜性腎病發(fā)病較為隱匿，約1/3的患者會發(fā)展成終末期腎病，將終生需要接受治療。腎病綜合征與藥物治療引起的并發(fā)癥可導(dǎo)致患者殘疾甚至危及生命，因此對膜性腎病及時確診與治療尤為重要[7]。目前臨床上主要依靠腎穿刺活檢術(shù)對膜性腎病進行診斷，同時通過光鏡、免疫熒光及電鏡檢查輔助評價腎小球病變情況，再結(jié)合發(fā)病因素篩查結(jié)果，若與抗磷脂酶A2受體抗體相關(guān)，則診斷為IMN；若繼發(fā)于某些疾病、藥物之后，病因明確，則診斷為SMN[8，9]。雖然診斷技術(shù)不斷進步，但膜性腎病的發(fā)病機制仍不明確。

自噬是細胞內(nèi)高度保守的降解機制，在酵母到人類等真核生物細胞內(nèi)廣泛存在，可降解長壽命蛋白、受損細胞器、氧化脂質(zhì)體、入侵微生物等。自噬參與維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定與基因組完整，細胞自噬異?？蓪?dǎo)致惡性腫瘤、腎臟疾病等發(fā)生[10]。近期研究[11，12]表明，多種腎小球疾病腎活檢組織足細胞自噬小體數(shù)發(fā)生變化，表明自噬可能參與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程，探究自噬作用過程可能為臨床診治腎臟疾病提供新思路。膜性腎病是腎小球疾病的常見類型，以免疫復(fù)合物沉積于足細胞基底膜為特征，病變部位主要在腎小球毛細血管袢，尤其是足細胞。足細胞作為腎小球血液濾過屏障的重要組成部分，其損傷、缺失是引發(fā)腎小球疾病和蛋白尿的主要因素。自噬在足細胞等終末分化細胞的生長與更新過程中發(fā)揮重要作用。有研究[13]顯示，綠色熒光標記LC3轉(zhuǎn)基因小鼠的腎小球足細胞區(qū)綠色熒光強度顯著增強，表明足細胞存在較高的基礎(chǔ)自噬活性。另有研究[14]發(fā)現(xiàn)，人足細胞同樣存在基礎(chǔ)自噬活性。本研究結(jié)果顯示，對照組足細胞中也存在較多的自噬體，足細胞中LC3、Beclin-1表達較強，進一步驗證了人足細胞存在基礎(chǔ)自噬活性。

自噬相關(guān)蛋白LC3在進化過程中高度保守，包括Ⅰ型與Ⅱ型，LC3-Ⅰ定位在胞質(zhì)內(nèi)，其可與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ；LC3-Ⅱ定位在自噬體膜的表面，參與自噬體的形成，常被用于評估細胞自噬的程度[15]。Beclin-1主要在自噬體形成前期產(chǎn)生，參與調(diào)節(jié)其他自噬相關(guān)蛋白的定位[16]。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，足細胞分化、損傷修復(fù)等過程中伴隨有自噬現(xiàn)象[17]。微小病變腎病患者足細胞Beclin-1表達水平高于腎小球硬化患者，復(fù)檢發(fā)現(xiàn)足細胞Beclin-1水平下降、自噬活性降低，則說明微小病變腎病已進展為腎小球硬化。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Heymann腎炎小鼠模型足細胞損傷時，早期足細胞自噬開始活化，持續(xù)保持較高水平；隨著病程進展，后期腎組織病變加劇、尿蛋白大量排泄，足細胞自噬活性反而降低，且有足細胞凋亡[18]。

本研究結(jié)果顯示，IMN組和SMN組足細胞自噬體數(shù)量較對照組減少，LC3、Beclin-1相對表達量均低于對照組；且IMN組、SMN組臨床分期為Ⅱ期、24 h UP≥3.5 g/L、Alb≥30 g/L、eGFR≥60 mL/(min·1.73 m2)的患者足細胞自噬體數(shù)量分別少于臨床分期為Ⅰ期、24 h UP<3.5 g/L、Alb<30 g/L、eGFR<60 mL/(min·1.73 m2)的患者。上述結(jié)果提示IMN與SMN患者足細胞自噬體數(shù)量可能與疾病的進展程度有關(guān)，自噬與膜性腎病患者足細胞損傷過程密切相關(guān)，隨著病情進展，足細胞自噬活性下降。本研究結(jié)果對膜性腎病的診斷及治療相關(guān)研究有一定參考價值。