韓曉春，張峰，劉長虹，張懷鳳，顧良臻，劉雅楠，封俊辰，楊哲

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟南250355；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3山東省千佛山醫(yī)院)

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)全球發(fā)病率高達(dá)25%[1]，也是我國第二大類慢性肝病[2]，嚴(yán)重影響生命健康。目前臨床治療NAFLD多以降脂、增強胰島素敏感性和肝臟保護(hù)為主，缺乏針對性的治療藥物[3,4]。祖國醫(yī)學(xué)對NAFLD治療積累了豐富的經(jīng)驗，認(rèn)為NAFLD病機與肝失疏泄、脾失健運有關(guān)，治療當(dāng)以除邪補虛、益氣健脾為宜。人參可補虛扶正，順應(yīng)肝氣運化，起到治療NAFLD的效果，但其具體作用成分及藥效缺乏實驗驗證。2018年3～8月，本研究構(gòu)建了NAFLD小鼠模型，觀察人參皂苷Rb1的治療作用，以期豐富NAFLD治療藥物種類，為NAFLD治療提供新的切入點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康C57BL/6小鼠40只[濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號SCXK(魯)2014-0007]，6周齡，雄性，體質(zhì)量20～25 g，SPF級環(huán)境喂養(yǎng)，溫度25 ℃，濕度50%～70%。

1.2 NAFLD模型制作及Rb1給藥方法 40只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量隨機分為模型組30只、正常對照組10只。對照組給予MCS飼料(即蛋氨酸、膽堿完全正常的飼料)喂養(yǎng)，模型組給予MCD飼料(蛋氨酸、膽堿聯(lián)合缺乏飼料)喂養(yǎng)制作NAFLD模型[5,6]，飼養(yǎng)周期為4周。造模成功后對模型組小鼠進(jìn)一步隨機分組，分為模型對照組、高劑量組和低劑量組，每組10只。參考《中華人民共和國藥典》(2015)，高劑量組和低劑量組小鼠分別通過灌胃給予80、40 mg/(kg·d)的Rb1，給藥體積為0.5 mL/kg，1次/d，連續(xù)給藥15 d。

1.3 小鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、脾臟質(zhì)量檢測 實驗過程中記錄小鼠體質(zhì)量變化，給藥15 d后處死小鼠，摘取肝臟、脾臟稱重，計算肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)。

1.4 肝功能檢測 小鼠處死后，腹主動脈取血，肝素抗凝，離心后收集血漿，采用生化分析儀(日立7600)檢測血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。

1.5 血脂檢測 采用生化分析儀(日立7600)檢測各組小鼠血漿總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)。

1.6 肝組織病理檢查 小鼠處死后摘除肝臟，用生理鹽水稍作沖洗后以4%多聚甲醛固定，浸蠟，脫水，透明，浸蠟，包埋后切為4～8 μm的薄片，HE染色，鏡下觀察肝臟組織病理變化。

1.7 肝組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測 小鼠處死后，迅速取出肝臟，冰上研磨后離心，取上清液，采用ELISA法檢測MDA、SOD。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量及肝、脾質(zhì)量比較 模型對照組、低劑量組、高劑量組小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、脾質(zhì)量和脾臟系數(shù)均低于正常對照組(P均<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量及肝、脾質(zhì)量比較

注：與正常對照組相比，*P<0.01。

2.2 各組小鼠血漿ALT、AST水平比較 模型對照組、低劑量組、高劑量組血漿ALT、AST水平均高于正常對照組(P均<0.01)，高劑量組血漿ALT、AST水平低于模型對照組和低劑量組(P均<0.05)，低劑量組血漿AST水平低于模型對照組(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血漿ALT、AST水平比較

注：與正常對照組相比，**P<0.01；與模型對照組相比，△P<0.05，△△P<0.01；與低劑量組相比，▽P<0.05，▽▽P<0.01。

2.3 各組小鼠TC、TG水平比較 模型對照組、低劑量組、高劑量組TC、TG水平均低于正常對照組(P均<0.05)；高劑量組TC水平高于模型對照組，TG水平高于低劑量組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠TC、TG水平比較

注：與正常對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組相比，△P<0.05；與低劑量組相比，▽P<0.05。

2.4 各組小鼠肝組織病理變化 正常對照組小鼠肝細(xì)胞無明顯病變，無脂肪變性，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞索排列整齊，血管周圍未見炎細(xì)胞浸潤。模型對照組肝細(xì)胞內(nèi)可見大量脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)充滿大小不一的脂滴，肝小葉內(nèi)可見炎細(xì)胞浸潤；低劑量組和高劑量組脂肪變性均有所減輕，脂滴大小不一，其中高劑量組血管周圍炎細(xì)胞浸潤程度明顯好轉(zhuǎn)。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織病理變化(HE染色)

2.5 各組小鼠肝組織中MDA、SOD表達(dá)比較 模型對照組、低劑量組、高劑量組小鼠肝組織中MDA、SOD表達(dá)均高于正常對照組，高劑量組肝組織中MDA表達(dá)低于模型對照組和低劑量組，低劑量組、高劑量組肝組織中SOD表達(dá)均低于模型對照組(P均<0.01)。見表4。

表4 各組小鼠肝組織中MDA、SOD表達(dá)比較

注：與正常對照組相比，*P<0.01；與模型對照組相比，△P<0.01；與低劑量組相比，▽P<0.01。

3 討論

NAFLD是臨床常見疾病，其發(fā)生往往伴有其他代謝性疾病，如肥胖、血脂紊亂、高血壓、2型糖尿病(T2DM)等[7,8]。雖然許多學(xué)者認(rèn)為NAFLD為良性病變，但流行病學(xué)調(diào)查[9,10]顯示有10%～20%的患者最后可發(fā)展為肝硬化，其中28%的肝硬化患者會發(fā)展成肝細(xì)胞癌乃至肝衰竭，1.7%死于肝硬化并發(fā)癥。目前NAFLD發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，但其機制不明確，也缺乏有效的防治藥物。

中醫(yī)經(jīng)典文獻(xiàn)中無“脂肪肝”定義，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，常將其歸屬為“積聚”“脅痛”“痞滿”等范疇。中國中醫(yī)研究院朱振紅等[11]根據(jù)《難經(jīng)·第五十六難》中“肝之積，名曰肥氣，在左脅下，如覆杯，有頭足”，以肝積論之。中醫(yī)理論認(rèn)為，此病病位在肝，與脾、胃、腎關(guān)系密切。痰濁久聚為標(biāo)，肝、脾、腎虧虛為本，本虛標(biāo)實證居多。脾主運化，脾虛則運化痰濁乏力，痰濕久聚成積，積聚亦阻礙氣機，加重積聚。人參甘，微溫，歸脾、肺、心、腎經(jīng)，為后天補脾益氣之要藥。脾健則水濕得運，氣旺則痰濁得行。除化痰濕積聚之標(biāo)外，人參亦可補肝腎虛之本，標(biāo)本兼顧，配以疏肝行氣之品則效果益著。

近年來研究發(fā)現(xiàn),人參提取物人參皂苷對酒精性脂肪肝和NAFLD均具有治療作用。有學(xué)者[12]以人參花提取物治療酒精性脂肪肝大鼠模型，發(fā)現(xiàn)治療組血清TC、TG水平明顯降低。陳靜等[13]在油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變模型中發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1能夠顯著降低TG含量，減輕胞內(nèi)脂質(zhì)堆積。彭璇等[14]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1可減輕高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠模型的脂肪肝浸潤現(xiàn)象，低劑量(5 mg/kg)即出現(xiàn)脂肪顆粒明顯減少，高劑量組(20 mg/kg)則完全看不到脂滴。這種作用與Rb1改善肝臟脂酰CoA合成酶1(CoASH1)、肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶I(CATI)、脂酰CoA氧化酶1(ACOX1)等β-氧化相關(guān)酶的功能相關(guān)。有學(xué)者[15]在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)，Rb1能夠顯著降低肝組織中TG含量，減輕肝臟質(zhì)量，其作用機制與腺苷酸活化蛋白激酶的激活有關(guān)。

本研究結(jié)果也顯示，Rb1對MCD誘導(dǎo)的小鼠NAFLD模型具有顯著治療作用。它可以保護(hù)C57BL/6小鼠肝功能，并在一定程度上調(diào)節(jié)血脂變化。從病理切片上看，Rb1可明顯減少肝細(xì)胞內(nèi)脂肪蓄積，減輕炎細(xì)胞浸潤和壞死，緩解NAFLD病情。為研究其治療機制，我們檢測了小鼠肝組織中的MDA和SOD，結(jié)果顯示，Rb1能夠明顯減輕NAFLD小鼠肝臟過氧化程度，具有明顯的抗氧化作用，且高劑量組[80 mg/(kg·d)]效果更為顯著。

氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化是NAFLD發(fā)病的重要機制之一[16]。TG等在肝臟蓄積，本身及其代謝產(chǎn)物可導(dǎo)致線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)代謝壓力增高，引起活性氧簇(ROS)募集，并進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的發(fā)生。SOD是機體清除ROS的重要介質(zhì)，MDA則是ROS作用的終產(chǎn)物。MCD誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)SOD、MDA增高也進(jìn)一步證明NAFLD存在氧化應(yīng)激失衡和脂質(zhì)過氧化[17,18]。Rb1能夠降低SOD、MDA含量，發(fā)揮抗氧化作用，進(jìn)而起到治療NAFLD的效果。

MCD飼料是膽堿、蛋氨酸聯(lián)合缺乏的飼料，通過人為引起小鼠脂肪酸代謝障礙，誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變。該造模方法可導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量下降，與人類NAFLD發(fā)病過程并不完全一致。但由于MCD喂養(yǎng)小鼠早期即可出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性，有明顯的氣球樣變特征，非常類似人類NAFLD表現(xiàn)，因此國際上仍將此法作為公認(rèn)的NAFLD動物模型制作方法[19,20]。在本研究基礎(chǔ)上，我們計劃開展Rb1作用于高糖高脂小鼠的效果研究，以進(jìn)行重復(fù)性驗證。

綜上所述，Rb1能夠減輕NAFLD小鼠肝臟過氧化程度，減少肝臟脂肪堆積，改善肝功能，并在一定程度上調(diào)節(jié)血脂，起到治療NAFLD的作用。本研究結(jié)果提示Rb1很可能成為治療NAFLD的理想藥物，這對豐富NAFLD藥物種類、改善NAFLD治療效果都具有重要意義。