李雯，甄潔玉，周利軍，茍?jiān)P，韓雪，劉會(huì)玲

(1甘肅省人民醫(yī)院，蘭州730000；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

宮頸癌是女性僅次于乳腺癌的常見(jiàn)惡性腫瘤，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)2012年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例約52.8萬(wàn)例，年死亡病例數(shù)達(dá)26.6萬(wàn)，其中85%以上發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家。我國(guó)每年新發(fā)病例超過(guò)13萬(wàn)，占世界宮頸癌新發(fā)病例的1/4，嚴(yán)重威脅婦女健康[1]。研究認(rèn)為，腫瘤免疫微環(huán)境改變?cè)谀[瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移中具有重要作用。白細(xì)胞介素28B(IL-28B)屬于Ⅲ型干擾素(IFN-λs)家族，可通過(guò)上調(diào)干擾素的表達(dá)從而發(fā)揮抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)以及調(diào)節(jié)免疫等生物學(xué)功能[2]。IL-28B的受體由IFN-λR1(IL-28Rα)和IL-10R2組成，其中IL-28Rα是組織特異性的，使機(jī)體不易產(chǎn)生耐受并降低其不良反應(yīng)，因此有望成為新的臨床抗病毒藥物。新近的國(guó)內(nèi)外報(bào)道顯示，IL-28B基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)與肝癌[3]、非小細(xì)胞肺癌[4]、食管癌[5]等腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，但是IL-28B與宮頸癌的關(guān)系鮮有報(bào)道。2017年1月1日～2018年1月31日，我們采用PCR技術(shù)擴(kuò)增血液IL-28B(rs12979860、rs8099917)的特異性片段，擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序分析其基因型、等位基因頻率，并應(yīng)用RT-qPCR法觀察宮頸癌患者外周血IL-28B mRNA水平變化，探討其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 抽取同期就診于甘肅省人民醫(yī)院婦科的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)患者為宮頸錐切術(shù)后患者；②宮頸癌術(shù)前患者為初診未治者，在取得血標(biāo)本前均未接受手術(shù)或放化療等治療；③宮頸癌術(shù)后患者為行宮頸癌手術(shù)治療者；④患者均經(jīng)2名以上有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師確診；⑤均為漢族。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并乙型肝炎、丙型肝炎、HIV等傳染性疾病或肝癌；②合并自身免疫性疾病或正接受免疫抑制治療者；③合并尖銳濕疣；④合并子宮其他惡性腫瘤，如子宮內(nèi)膜癌、卵巢惡性腫瘤等。共收集LSIL(LSIL組)、HSIL(HSIL組)患者及宮頸癌術(shù)前(術(shù)前組)、術(shù)后患者(術(shù)后組)各30例，LSIL組年齡(44.45±10.77)歲，HSIL組年齡(50.14±9.34)歲；宮頸癌患者中，術(shù)前組年齡(54.70±8.518)歲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，術(shù)后組年齡(52.56±9.41)歲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例；選擇同期成年體檢健康女性30例作為對(duì)照組，年齡(52.56±9.41)歲，均為漢族。各組年齡、民族具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)收集本 采集所有受試者清晨空腹血3 mL，并用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，2 h內(nèi)離心分裝。

1.2.2 外周血IL-28B基因多態(tài)性檢測(cè) 應(yīng)用DNA提取試劑盒(北京全式金生物公司)進(jìn)行全血DNA提取，-20 ℃保存。用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)rs12979860、rs8099917位點(diǎn)上下游引物，由華大基因合成。rs12979860上游引物5′-ATTCCTGGACGTGGATGGGTAC-3′，下游引物為5′-AGCGCGGAGTGCAATTCA-3′；rs8099917上游引物為5′-TTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTT-3′，下游引物為5′-TGGGAGAATGCAAATGAGAGATA-3′。對(duì)rs12979860、rs8099917位點(diǎn)DNA片段進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系25 μL：PFU酶0.5 μL，10 Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。rs12979860位點(diǎn)反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min；rs8099917位點(diǎn)反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。IL-28B rs12979860位點(diǎn)PCR產(chǎn)物大小為330 bp，rs8099917位點(diǎn)PCR產(chǎn)物大小為460 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，直接送基因公司進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用Bio-Rad CFX Manager軟件分析各位點(diǎn)基因型。

1.2.3 外周血IL-28B mRNA檢測(cè) 采用RT-qPCR法。通過(guò)Primer Premier軟件設(shè)計(jì)IL-28B、內(nèi)參基因GADPH引物序列，由華大基因合成。IL-28B上游引物為5′-GTGCAGTTCCCACCTCATCT-3′，下游引物為5′-CTGTGGCCTGAAGCTGTGTA-3′；GADPH上游引物為5′-GTGCAGTTCCCACCTCATCT-3′，下游引物為5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。TRIzol法提取血液總RNA，取約1 μg總RNA，按照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后，進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系(25 μL)：cDNA 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL， SYBR Premix EX Taq 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，(95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)35個(gè)循環(huán)。以GADPH作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt計(jì)算IL-28B mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組IL-28B rs1979860、rs8099917位點(diǎn)基因型和等位基因分布情況 多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)，符合H-W遺傳平衡(χ2=2.842，P=0.596)。IL-28B rs12979860、rs8099917位點(diǎn)基因型、基因頻率在各組間分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組IL-28B rs1979860、rs8099917位點(diǎn)基因型和等位基因分布情況(例)

2.2 各組外周血IL-28B mRNA水平比較 LSIL組、HSIL組、術(shù)前組、術(shù)后組外周血IL-28B mRNA水平依次為99.23±11.67、78.87±21.97、20.90±8.89、192.34±22.65，均低于對(duì)照組的308.56±34.55(P均<0.01)。LSIL組外周血IL-28B mRNA高于HSIL組(t=2.728，P=0.011)，HSIL組外周血IL-28B高于術(shù)前組(t=12.995，P=0.001)，而術(shù)后組外周血IL-28B高于術(shù)前組(t=38.591，P=0.001)。

2.3 外周血IL-28B mRNA水平與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 宮頸癌患者中，術(shù)前組無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者外周血IL-28B mRNA水平為26.62±7.07，高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的14.37±5.68(t=5.18，P=0.001)；術(shù)后組無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者外周血IL-28B mRNA水平為199.64±22.88，高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的175.30±9.15(t=3.061，P=0.005)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，IL-28B rs12979860 TT基因型增加病毒相關(guān)性肝癌、肝硬化的發(fā)病[6]，CC基因型可作為抗病毒治療高應(yīng)答率的預(yù)測(cè)因素[7]。rs8099917位點(diǎn)多態(tài)性與丙型肝炎病毒(HCV)感染易感性相關(guān)，G為HCV感染的風(fēng)險(xiǎn)等位基因[8]。rs12979860位點(diǎn)CC型可作為抗病毒治療高應(yīng)答率的預(yù)測(cè)因素[9]。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道，IL-28B基因多態(tài)性與腎細(xì)胞癌的疾病進(jìn)展相關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，rs12979860位點(diǎn)基因型分布以純合子CC為主，其次為CT/TT基因型；而rs8099917位點(diǎn)的基因型分布以純合子TT為主，其次為T(mén)G/GG基因型，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符[11]。但是，組間比較發(fā)現(xiàn)含有突變位點(diǎn)基因型(T/C、T/G)并未增加宮頸疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，說(shuō)明IL-28B的多態(tài)性位點(diǎn)rs12979860、rs8099917可能與宮頸癌無(wú)明顯相關(guān)性。

研究顯示，肝癌中存在IL-28B差異表達(dá)的現(xiàn)象[12,13]。Srinidhi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HIV感染者IL-28B表達(dá)較健康人群顯著降低，而經(jīng)過(guò)6～9個(gè)月抗病毒治療后，IL-28B表達(dá)顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)，外周血IL-28B mRNA水平在LSIL組、HSIL組、術(shù)前組、術(shù)后組均不同程度低于健康對(duì)照組，且宮頸癌術(shù)后組較術(shù)前組IL-28B mRNA明顯回升，意味著IL-28B在宮頸疾病中可能是一個(gè)保護(hù)性因子。研究表明，Tregs可抑制機(jī)體免疫應(yīng)答從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)構(gòu)建U14宮頸癌細(xì)胞小鼠(Babl/C和c57bl/6j)皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)腺病毒載體介導(dǎo)的IL-28B(Ad-mIL-28B)能抑制小鼠U14宮頸癌皮下移植瘤的瘤體生長(zhǎng)和腫瘤在肝、肺中的轉(zhuǎn)移、降低小鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞的比例。因此，推測(cè)Ad-mIL-28B可能通過(guò)降低CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例從而發(fā)揮抑制U14宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抗腫瘤作用[15]。張冬紅[16]在對(duì)HeLa宮頸癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，再次驗(yàn)證了IL-28B的抗腫瘤作用。韓雪等[17]通過(guò)流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)22例宮頸癌術(shù)前患者、24例宮頸癌術(shù)后患者及29例健康對(duì)照者的外周血標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Tregs的細(xì)胞數(shù)量增加。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，IL-28B mRNA在宮頸癌患者外周血中呈低水平。結(jié)合上述的文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測(cè)宮頸癌可能與機(jī)體IL-28B表達(dá)量不足或功能缺陷導(dǎo)致Tregs等細(xì)胞引起的機(jī)體免疫抑制相關(guān)。

宮頸癌盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否，被認(rèn)為是影響術(shù)后療效的關(guān)鍵因素[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌患者中，術(shù)前組、術(shù)后組外周血IL-28B mRNA水平在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示IL-28B的表達(dá)在宮頸癌的疾病發(fā)展甚至腫瘤轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。這與相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[15,16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，外周血IL-28B mRNA水平在宮頸癌術(shù)前組最低，在HSIL組、LSIL組中次低，而宮頸癌術(shù)后組雖仍低于健康對(duì)照組，但存在一定程度的回升，可見(jiàn)IL-28B可能在同一疾病的不同階段存在差異表達(dá)。這與譚超月等[19]對(duì)宮頸病變患者血清、陰道灌洗液中細(xì)胞因子表達(dá)的研究結(jié)果基本一致。Apostolou等[20]在對(duì)干燥綜合征的研究中發(fā)現(xiàn)，小涎腺腺體組織中IL-28A、IL-28B的免疫組化著色高于對(duì)照組織，尤其是中度病變的患者，但重度病變患者IL-28A、IL-28B的表達(dá)反而低于中度病變者。鄭金旭等[21]、范利娟等[22]通過(guò)構(gòu)造肺纖維化小鼠模型，并于造模后第7、14、21、28天分別檢測(cè)肺組織中IL-28B的表達(dá)；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給藥后第14天出現(xiàn)IL-28B的表達(dá)高峰后逐漸下降，給藥第28天后表達(dá)水平與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，表明IL-28B在肺纖維化的損傷的進(jìn)程中僅在早期病變中高表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-28B mRNA在宮頸疾病中的這種差異表達(dá)，提示IL-28B的表達(dá)在宮頸癌的疾病進(jìn)展中可能發(fā)揮了一定作用。推測(cè)其可能的機(jī)制，我們認(rèn)為L(zhǎng)SIL組、HSIL組外周血IL-28B mRNA高于宮頸癌術(shù)前組、術(shù)后組，可能由于HPV等刺激導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞、局部的巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生的IL-28B增多；而隨著疾病進(jìn)一步進(jìn)展惡化至宮頸癌時(shí)，被HPV“侵蝕的”上皮細(xì)胞等大量凋亡甚至脫落進(jìn)而使IL-28B表達(dá)量降低。

綜上所述，IL-28B基因的rs12979860、rs8099917多態(tài)性位點(diǎn)可能與宮頸癌發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)性，IL-28B可能主要通過(guò)表達(dá)量的不同進(jìn)而影響宮頸疾病的進(jìn)展甚至腫瘤轉(zhuǎn)移。但是，本研究樣本量較小、實(shí)驗(yàn)條件有限，并未能收集宮頸組織標(biāo)本進(jìn)一步驗(yàn)證宮頸組織中IL-28B mRNA的表達(dá)。本研究所發(fā)現(xiàn)的IL-28B在宮頸疾病各個(gè)階段中的差異表達(dá)現(xiàn)象，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究其可能的機(jī)制。