何劍戈，夏群，吳凱楠，楊凱銳1，，賈棟1，，李明昊

(1中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院，天津300000；2中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心；3中國(guó)人民解放軍92126部隊(duì)；4天津醫(yī)科大學(xué)；5天津中醫(yī)藥大學(xué))

銀屑病性關(guān)節(jié)炎(PsA)是一種慢性、免疫介導(dǎo)性的炎癥性關(guān)節(jié)病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)和血管的炎癥，包括軸向骨骼的炎癥，并與心血管疾病的病死率增加有關(guān)[1]。銀屑病關(guān)節(jié)炎與不同程度的殘疾有關(guān)，延誤診斷還可增加死亡風(fēng)險(xiǎn)，因此，早診斷、早治療可預(yù)防關(guān)節(jié)破壞及改善預(yù)后[2，3]。目前還沒(méi)有公認(rèn)的血清學(xué)篩查方法用于該病的早期診斷。PsA病因尚不清楚，可能是遺傳、免疫和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。PsA有明顯的遺傳因素，許多基因都與該病的易感性有關(guān)[4]?；蛐酒夹g(shù)有助于確定某種疾病特異的診斷標(biāo)志物或關(guān)鍵的致病基因[5]。生物信息學(xué)是分析處理生物分子信息、揭示生物分子信息內(nèi)涵的一種技術(shù)[6]，可在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲取大量信息，用于遺傳性疾病的預(yù)防、診斷和治療相關(guān)研究[7]。2018年5～10月，本研究以PsA基因芯片數(shù)據(jù)作為研究對(duì)象，篩選PsA的致病基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 本研究所用芯片數(shù)據(jù)來(lái)源于美國(guó)生物信息技術(shù)中心(NCBI)的公共基因芯片數(shù)據(jù)(GEO)，芯片數(shù)據(jù)編號(hào)為GSE61281，基于GPL6480平臺(tái)(Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F)，疾病類(lèi)型為PsA和銀屑病[8]。該芯片數(shù)據(jù)有52個(gè)樣本，包括12個(gè)來(lái)自正常人的外周血樣本(對(duì)照組)、20個(gè)PsA患者的外周血樣本(試驗(yàn)組)和20例銀屑病患者的外周血樣本(試驗(yàn)組)。本研究分析12個(gè)對(duì)照組外周血樣本和20個(gè)PsA患者外周血樣本的芯片數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選及優(yōu)化 利用R編程軟件對(duì)系列矩陣文件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[9]。將芯片探針名轉(zhuǎn)化為基因名。對(duì)于多個(gè)探針與同一基因?qū)?yīng)者，基因表達(dá)量取多個(gè)探針上的均值。預(yù)處理前芯片數(shù)據(jù)共有41 092個(gè)探針?lè)?hào)，通過(guò)對(duì)原始芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、刪去無(wú)相應(yīng)基因符號(hào)探針及歸一化處理，得到19 595個(gè)沒(méi)有重復(fù)的基因符號(hào)。用R軟件limma工具包篩選對(duì)照組與PsA試驗(yàn)組芯片數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因[10]，選擇校正P<0.05且差異表達(dá)倍數(shù)為1.5倍以上者作為差異表達(dá)基因。在GLAD4U數(shù)據(jù)庫(kù)(該數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)檢索PUBMED文獻(xiàn)，可明確基于現(xiàn)階段科學(xué)認(rèn)知水平較可信的致病基因，即已知基因[11])中輸入關(guān)鍵詞“psoriatic arthritis”來(lái)檢索PsA的已知基因。但仍有很多與PsA致病相關(guān)且未研究過(guò)的基因，在GLAD4U數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)法檢索到。為排除在樣本收集、芯片測(cè)序過(guò)程中發(fā)生的污染及在芯片數(shù)據(jù)分析時(shí)發(fā)生的偏差，需要對(duì)初篩的差異基因進(jìn)行優(yōu)化提升。將GLAD4U數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的已知基因作為訓(xùn)練集，將通過(guò)R軟件篩選得到的差異表達(dá)基因作為測(cè)試集，通過(guò)ToppGene數(shù)據(jù)庫(kù)(該數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)兩組基因在功能上的相似性對(duì)疾病候選基因進(jìn)行優(yōu)化和排序)優(yōu)化測(cè)試集，最終選擇綜合P<0.01、綜合得分>0.6的基因作為差異表達(dá)基因中與PsA相關(guān)性更高的基因，將這些基因和訓(xùn)練集內(nèi)的已知基因共同納入致病基因。

1.3 致病基因的富集分析 利用David(https://david.ncifcrf.gov)在線工具對(duì)致病基因進(jìn)行GO富集分析，選擇經(jīng)過(guò)Benjamini校正后P<0.05的基因本體[12]。利用Kobas數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)致病基因進(jìn)行KEGG分析[13]，選擇經(jīng)過(guò)Benjamini校正后P<0.05的通路作為致病基因的主要富集通路。

1.4 致病基因PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PsA致病基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，并建立可視化PPI網(wǎng)絡(luò)圖，計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)基因的節(jié)點(diǎn)度(某致病基因與其他致病基因有直接聯(lián)系的數(shù)目)，可獲得在PPI網(wǎng)絡(luò)中與其他致病基因有密切聯(lián)系的基因。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選及優(yōu)化結(jié)果 利用R編程語(yǔ)言的limma工具包篩選差異基因，共獲得差異表達(dá)基因104個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)基因83個(gè)、表達(dá)下調(diào)基因21個(gè)。GLAD4U數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索獲得已知基因59個(gè)。將已知基因作為訓(xùn)練集，差異表達(dá)基因作為測(cè)試集，通過(guò)ToppGene數(shù)據(jù)庫(kù)優(yōu)化測(cè)試集，篩選出15個(gè)與已知基因功能相似的基因。將這15個(gè)基因與已知基因共同納入PsA的致病基因。差異表達(dá)基因中與PsA高度相關(guān)(得分較高且差異顯著)的基因?yàn)镃XCL10、LYN、JAK1、CARD11、ANXA1。

2.2 致病基因的富集分析結(jié)果 經(jīng)過(guò)David在線工具進(jìn)行GO富集分析，得到199個(gè)致病基因富集的基因本體。P<0.05、基因富集個(gè)數(shù)排列前15個(gè)的基因本體見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)KOBAS在線工具進(jìn)行KEGG富集分析，得到94個(gè)致病基因富集的KEGG通路。P<0.05、基因富集個(gè)數(shù)排列前15個(gè)的KEGG通路見(jiàn)表2。

表1 致病基因的GO富集分析結(jié)果

注：MF為分子功能；BP為生物過(guò)程；CC為細(xì)胞組成。

表2 致病基因的KEGG通路富集分析結(jié)果

2.3 致病基因的PPI網(wǎng)絡(luò) 致病基因的PPI網(wǎng)絡(luò)中TNF節(jié)點(diǎn)度較大，即TNF在PPI網(wǎng)絡(luò)中與其他基因的直接作用較多，聯(lián)系密切。IL1B、IL13、IL17A、CCL2等基因也有較大的節(jié)點(diǎn)度。見(jiàn)圖1。

圖1 PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)數(shù)排名前10位的致病基因

3 討論

通過(guò)對(duì)來(lái)自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)基因芯片的分析，可以了解某些基因在疾病發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制。然而，基因芯片分析得到的差異表達(dá)基因?qū)M(jìn)一步探究發(fā)病機(jī)制的指導(dǎo)作用并不明確。本研究從GLAD4U數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出與PsA發(fā)病密切相關(guān)的已知基因，并將其作為訓(xùn)練集，將分析基因芯片得到的差異基因作為測(cè)試集，通過(guò)ToppGene數(shù)據(jù)庫(kù)優(yōu)化測(cè)試集，最終選擇綜合P<0.01、綜合得分>0.6的基因作為差異表達(dá)基因中與PsA相關(guān)性更高的基因，將這些基因和訓(xùn)練集內(nèi)的已知基因共同組成致病基因。差異表達(dá)基因中與PsA高度相關(guān)的基因?yàn)镃XCL10、LYN、JAK1、CARD11、ANXA1。

JAK-1是優(yōu)化的差異基因中得分較高(0.920 833 852)且顯著(P=4.01E-05)的基因。JAK家族(JAK-1、JAK-2、JAK-3、TYK-2)在免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。JAK-3與JAK-1結(jié)合對(duì)IL的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起重要作用。IL廣泛參與淋巴細(xì)胞活化、功能和增殖。JAK-3主要表達(dá)于造血細(xì)胞，包括NK細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和活化的T、B淋巴細(xì)胞。JAK-1可與其他JAK家族成員結(jié)合，發(fā)出其他細(xì)胞因子的信號(hào)。因此，抑制JAK蛋白是調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞免疫應(yīng)答有力的靶點(diǎn)[14]。PsA與炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)，JAK-1的異常表達(dá)有可能與PsA的發(fā)生相關(guān)。

CXCL10基因在優(yōu)化的差異基因中得分排名第二。CXCL10蛋白可與受體CXCR3結(jié)合，通過(guò)激活和招募白細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。最近研究顯示，CXCL10在多種自身免疫性疾病(如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、系統(tǒng)性硬化癥和特發(fā)性炎性肌病等)患者的血清和(或)組織中表達(dá)有所增加。本課題組最近研究表明，CXCL10在骨破壞中也發(fā)揮一定作用。除了趨化效應(yīng)外，CXCL10還可能具有多效性功能。進(jìn)一步研究這種趨化因子的功能及CXCL10與其他細(xì)胞因子、趨化因子之間的相互作用，有助于為多種自身免疫性疾病探索治療靶點(diǎn)[15]。在本研究中CXCL10基因綜合得分較高，提示其與PsA的發(fā)病高度相關(guān)。有研究表明CXCL10可能涉及到PsA的發(fā)病機(jī)制，認(rèn)為它是預(yù)測(cè)銀屑病的一種生物標(biāo)志物[16]。本研究結(jié)果與之一致。

本研究對(duì)致病基因進(jìn)行富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在炎癥、免疫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的生物過(guò)程中富集的基因較多且較顯著，如免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、固有免疫反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、對(duì)脂多糖的應(yīng)答等。有學(xué)者[17，18]曾報(bào)道PsA是一種炎癥和免疫性疾病并且與遺傳易感性、環(huán)境因素有關(guān)。所以炎癥反應(yīng)和免疫功能異常可能是PsA發(fā)病的重要病理機(jī)制。KEGG分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PsA致病基因主要富集的通路是細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用、炎癥性腸病等。在細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用通路中，富集較多致病基因的通路為IL6/12樣細(xì)胞因子通路、IL17樣細(xì)胞因子通路、TNF家族通路。

血清TNF-α水平與PsA病情活動(dòng)CASPAR評(píng)分和各項(xiàng)炎癥指標(biāo)密切相關(guān)，是PsA發(fā)病的重要機(jī)制[19]。IL-17A在炎癥相關(guān)的關(guān)節(jié)炎和(或)皮膚疾病的發(fā)病中起關(guān)鍵作用。在明顯的關(guān)節(jié)炎癥之前，IL-17A可通過(guò)直接激活破骨細(xì)胞前體來(lái)誘導(dǎo)病理性骨吸收[20]。在對(duì)致病基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析中，我們發(fā)現(xiàn)TNF、IL1B、IL13、IL17A、CCL2等基因也有較大的節(jié)點(diǎn)度。進(jìn)一步說(shuō)明這些信號(hào)通路中富集的基因可能成為PsA診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。

本研究通過(guò)對(duì)PsA的基因芯片進(jìn)行生物信息學(xué)分析，找到了與PsA致病相關(guān)的核心基因及重要通路，為PsA的發(fā)病機(jī)制研究提供了重要的理論和數(shù)據(jù)支撐。對(duì)這些核心基因及通路進(jìn)一步研究有助于深入揭示PsA的發(fā)病機(jī)制。