許靜，孫誠(chéng)誼，喻超，何曉曉，楊盛力

(1貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng)550000；2貴州醫(yī)科大學(xué)肝膽胰脾重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院)

生物鐘是參與協(xié)調(diào)機(jī)體各種組織器官晝夜節(jié)律的一種內(nèi)源性調(diào)控系統(tǒng)，與人體各項(xiàng)生理活動(dòng)密切相關(guān)[1～3]。生物鐘的基本分子機(jī)制主要由一系列核心元件組成的轉(zhuǎn)錄、翻譯負(fù)反饋環(huán)構(gòu)成，包括PER1-3、CRY1-2、CLOCK、BMAL1、TIMELESS、NPAS2、NR1D1、DEC1、DEC2和RORA等。目前研究[4～7]表明，生物鐘調(diào)控系統(tǒng)紊亂與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其機(jī)制可能是生物鐘對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及耐藥等惡性生物學(xué)行為有一定影響。CRY2在人骨肉瘤、乳腺癌、大腸癌等多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)上調(diào)，且其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為[8，9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，生物鐘基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)具有顯著差異，對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展具有顯著意義[14，15]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，生物鐘基因可通過(guò)調(diào)控下游多種信號(hào)通路從而影響細(xì)胞周期及相關(guān)基因的表達(dá)，最終調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能。2018年5～9月,本研究觀察了過(guò)表達(dá)CRY2的肝癌細(xì)胞系HepG2增殖能力變化，及細(xì)胞中多種生物鐘基因和蛋白的表達(dá)變化，從而研究CRY2對(duì)肝癌細(xì)胞生物鐘網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 DMEM培養(yǎng)基、PBS和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒；PCR引物由武漢谷歌生物科技有限公司提供；鼠抗人CRY1單克隆抗體、兔抗人CRY2多克隆抗體及兔抗人CLOCK多克隆抗體購(gòu)于Abcam公司；兔抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司；鼠抗人PER3多克隆抗體購(gòu)于Novus公司；兔抗人PER1、PER2、BMAL1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；肝癌細(xì)胞系HepG2來(lái)自中國(guó)典型物種保藏中心；CRY2過(guò)表達(dá)病毒上清液及陰性對(duì)照病毒上清液的構(gòu)建和鑒定由上海吉?jiǎng)P基因公司進(jìn)行。

1.2 HepG2細(xì)胞分組及CRY2過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰酶消化細(xì)胞后均勻接種于編號(hào)1～6的6孔板中，每孔各加入2 mL含10%胎牛血清及1%抗生素的DMEM培養(yǎng)液，第1～3孔先加入5 μL的CRY2過(guò)表達(dá)病毒上清液(實(shí)驗(yàn)組)，第4～6孔先加入5 μL陰性對(duì)照病毒上清液(對(duì)照組)，并每孔均加入2 μL聚凝胺(polybrene)促進(jìn)轉(zhuǎn)染。于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換含10%胎牛血清及1%抗生素的DMEM培養(yǎng)液，每48 h更換1次培養(yǎng)液，連續(xù)7 d后實(shí)驗(yàn)組獲得CRY2穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的HepG2細(xì)胞。以未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞作為空白組。

1.3 HepG2細(xì)胞增殖情況觀察 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組的細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶的85%～90%時(shí)，用胰酶消化后離心收集，用含10%胎牛血清及1%抗生素的DMEM培養(yǎng)液重懸、計(jì)數(shù)，以2×103/mL接種于96孔板中，每孔加100 μL的培養(yǎng)液，每20孔分為一組，共三組。于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h，各組分別選取5孔檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。每孔棄培養(yǎng)基后，加入血清與CCK-8(100∶10)混合液110 μL，置于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于波長(zhǎng)460 nm處檢測(cè)各孔吸光度值，表示細(xì)胞增殖能力。

1.4 HepG2細(xì)胞中生物鐘基因檢測(cè) 采用real-time PCR法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中的生物鐘基因CLOCK、BMAL1、PER1、PER2、PER3、DEC1、DEC2、CRY1、CRY2、NPAS2 mRNA。收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，計(jì)算RNA濃度，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板，進(jìn)行基因擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×SYBR PremixEx TaqTMⅡ 12.5 μL，0.4 μmol/L的上、下游引物各1 μL，50 ng/μL的DNA模板2 μL，三蒸水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸 10 min。以β-actin為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取平均值。相關(guān)生物鐘基因及內(nèi)參基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 生物鐘基因及內(nèi)參基因引物序列

1.5 HepG2細(xì)胞中生物鐘基因蛋白檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組HepG2細(xì)胞用RIPA裂解液置于冰上裂解30 min，用細(xì)胞刮刀收集后于4 ℃、12 000 r/min離心機(jī)中離心5 min，收集上清液。用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。加入1/4體積的5×loading buffer，100 ℃加熱10 min。取10 μg蛋白樣品溶液于聚丙烯酰胺凝膠中電泳，凝膠濕轉(zhuǎn)PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入相應(yīng)的一抗抗體，4 ℃靜置孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min后加入相應(yīng)抗兔或抗鼠二抗IgG抗體，孵育1 h后洗膜3遍；暗室下將ECL發(fā)光液滴加在PVDF膜上，化學(xué)發(fā)光儀曝光，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并測(cè)量蛋白條帶灰度值。以目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)，各組細(xì)胞增殖能力呈增高趨勢(shì)。轉(zhuǎn)染48、72、96 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組和空白組降低(P均<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后各組細(xì)胞增殖能力比較

注：與同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組、空白組相比，*P<0.05。

2.2 兩組HepG2細(xì)胞中生物鐘基因及蛋白表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中PER1、PER2、PER3、CLOCK、CRY1、CRY2、BMAL1、NPAS2、DEC2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，DEC1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表3、4。

表3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞中生物鐘基因表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

表4 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞中生物鐘基因蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

3 討論

生物鐘是晝夜節(jié)律的分子基礎(chǔ)，它是一種內(nèi)源性的自身調(diào)節(jié)的循環(huán)過(guò)程，通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾等一系列過(guò)程，形成節(jié)律性的生理周期[11～13]。細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因主要由一系列呈節(jié)律表達(dá)的生物鐘基因及其相應(yīng)蛋白產(chǎn)物在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控。這種轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路的生物節(jié)律即是生物鐘的基本分子機(jī)制。[14～16]。CRYs可與生物鐘基因PERs形成復(fù)合體，從而調(diào)控生物鐘基因網(wǎng)絡(luò)[17]。目前已有報(bào)道生物鐘基因CRY2在多種腫瘤組織中的表達(dá)具有顯著差異，并調(diào)控下游腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，從而參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。CRY2作為生物鐘基因網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其在惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)是否導(dǎo)致生物鐘基因網(wǎng)絡(luò)中其他生物鐘基因表達(dá)的改變，目前尚未明確。

生物鐘基因除了其固有的生物鐘效應(yīng)外，近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明生物節(jié)律的異常表達(dá)還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、療效和預(yù)后等密切相關(guān)。生物鐘基因CRY2即是已發(fā)現(xiàn)的幾種參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的核心調(diào)控基因之一[19～21]。CRY2是晝夜節(jié)律核心振蕩器復(fù)合物的關(guān)鍵組分，其表達(dá)可受其他生物鐘基因調(diào)控。研究[13，16]表明生物鐘基因CLOCK/ARNTL形成的異二聚體可促進(jìn)CRY2表達(dá)上調(diào)，CRY2與PERs形成異二聚體與CLOCK/ARNTL相互作用在反饋環(huán)中抑制CRY2表達(dá)上調(diào)。CRY2通過(guò)調(diào)控生物鐘基因網(wǎng)絡(luò)，參與細(xì)胞DNA損傷檢查點(diǎn)控制和重要細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)調(diào)節(jié)。同時(shí)，還有研究[17]表明CRY2突變可增加細(xì)胞對(duì)基因毒性藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性，同時(shí)也抑制p53突變小鼠惡性腫瘤的早期發(fā)展。此外，乳腺癌細(xì)胞CRY2表達(dá)下調(diào)更容易導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)機(jī)制的破壞[18]。上述研究表明，CRY2可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，與患者的DNA損傷和化療效果也有關(guān)[19,20]。因此，深入研究其中分子生物學(xué)機(jī)制有助于提高腫瘤治療效果、改善患者預(yù)后。

本研究細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CRY2過(guò)表達(dá)后，HepG2細(xì)胞增殖能力顯著下降，提示CRY2基因表達(dá)變化影響肝癌細(xì)胞的增殖。我們進(jìn)一步檢測(cè)兩組細(xì)胞中生物鐘基因及蛋白發(fā)現(xiàn)，CRY2過(guò)表達(dá)后，肝癌細(xì)胞中PER1、PER2、PER3、CLOCK、CRY1、BMAL1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均上調(diào)。上述研究結(jié)果提示，CRY2上調(diào)后可能通過(guò)調(diào)控生物鐘網(wǎng)絡(luò)從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，然而CRY2調(diào)控生物鐘網(wǎng)絡(luò)的具體分子生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。本研究證實(shí)了CRY2過(guò)表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)能夠影響其他生物鐘基因的表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明了生物鐘基因CRY2及其調(diào)控的生物鐘網(wǎng)絡(luò)在肝癌的惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用。未來(lái)我們將深入研究CRY2調(diào)控生物鐘網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，最終為肝癌的臨床診斷及治療提供新思路。