肖 妍，李蓉蓉，霍 蕾，董志珍，張俊哲，趙 丹，楊若松，郭 鵬

（1. 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津 300461；2. 北京維德維康生物技術(shù)有限公司，北京 100095）

布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q布病）是由革蘭氏陰性的布魯氏菌屬細(xì)菌侵入機(jī)體后引起的變態(tài)反應(yīng)性疾病，屬于人獸共患傳染病[1]。布魯氏菌屬主要分為羊種、牛種、豬種、綿羊附睪種、犬種、沙林鼠種及海洋種布魯氏菌[2]。動物及人類對布魯氏菌普遍易感，母畜感染后的臨床癥狀主要是流產(chǎn)及不孕，而人類感染后則可表現(xiàn)為發(fā)熱、多汗、乏力、骨關(guān)節(jié)和肌肉疼痛、頭痛、流產(chǎn)、睪丸炎等非特異性多系統(tǒng)損傷[3]。布病在臨床容易被誤診為其他疾病，若治療不及時、不徹底，易轉(zhuǎn)化為慢性。目前尚無有效的治療慢性布病方法[4]。據(jù)統(tǒng)計，2014年我國新發(fā)布病病例數(shù)量較2013年增加了30.4%，發(fā)病率是1993年的154倍[5]，全國所有省份均有流行或散發(fā)病例的報告。

布病的病原學(xué)診斷主要是從疑似患者的血液或者組織中分離培養(yǎng)布魯氏菌來確診。細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)是最傳統(tǒng)的布病細(xì)菌學(xué)診斷方法，也是診斷布病的“金標(biāo)準(zhǔn)”[6]。然而布魯氏菌生長十分緩慢，營養(yǎng)要求復(fù)雜，培養(yǎng)環(huán)境要求高，且陽性檢出率低，所以布病的實驗室診斷多采用免疫學(xué)方法。比較常用的檢測方法有虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗、全乳環(huán)試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗以及免疫膠體金層析法[7]，如左玉柱等[8]建立的牛布魯氏菌間接ELISA抗體檢測方法，王志明等[9]通過篩選抗布魯氏菌單克隆抗體建立的檢測血清中布魯氏菌抗體的競爭ELISA方法。這些技術(shù)的建立與應(yīng)用為布病防控提供了較為可靠的技術(shù)支持，同時也彌補(bǔ)了以往診斷方法的不足。

免疫層析技術(shù)是20世紀(jì)80年代初崛起的一種新型免疫學(xué)分析技術(shù)[10]。其主要原理是通過硝酸纖維素膜的滲透作用，當(dāng)待檢的液體樣本流經(jīng)檢測區(qū)域時，被檢測物可與捕獲抗體發(fā)生特異性結(jié)合而發(fā)出標(biāo)記性信號[11]。張付賢等[12]建立了可成功鑒別牛種布魯氏菌感染和疫苗免疫的小鼠血清膠體金試紙條，準(zhǔn)確性同于ELISA方法。邵豐堯等[13]評價了用于布病現(xiàn)場檢測的膠體金產(chǎn)品，對人群和牛群的檢測結(jié)果敏感性與虎紅平板凝集檢測結(jié)果無明顯差異。免疫層析技術(shù)因具備價格低廉、操作簡單、不需要特殊的儀器設(shè)備和專業(yè)研究人員等優(yōu)點而備受青睞[14]?，F(xiàn)在市場上的免疫層析產(chǎn)品普遍是通過檢測動物血樣中的布魯氏菌抗體診斷布病[15-18]。本研究建立的檢測奶樣中布魯氏菌抗體的免疫層析試紙條更加簡便，可快速完成檢測，適用于奶牛場布病的初篩。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 羊種布魯氏菌WS-01強(qiáng)毒株：石河子大學(xué)鑒定、保存。

1.1.2 試驗用奶樣 布魯氏菌陰陽性牛奶樣、口蹄疫O型陽性牛奶樣、口蹄疫A型陽性牛奶樣、口蹄疫亞洲Ⅰ型陽性牛奶樣、牛副傷寒病陽性牛奶樣：均由北京維德維康制備、保存。

1.1.3 試劑和儀器 脂多糖（LPS）提取試劑盒：購買于iNtRON公司；布魯氏菌全乳環(huán)狀反應(yīng)抗原（RAA 0048）：購自AHVLA（Animal Health and Veterinary Laboratories Agency）；PVC背板、吸水紙：購自上海良信科技有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜）：購自上海杰一生物技術(shù)有限公司；玻璃纖維素膜：購自上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司；濾血膜：購自杭州科百特過濾器材有限公司；葡萄球菌A蛋白（SPA）：購自艾美捷科技有限公司，雞抗SPA：購自上海杰一生物技術(shù)有限公司；氯金酸、檸檬酸三鈉：購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；國外商品化試劑盒：購自IDEXX的布魯氏菌牛奶抗體檢測試劑盒和SVANOVA的布魯氏菌抗體檢測試劑盒。儀器包括：雙顯恒溫磁力加熱攪拌器，北京金紫光科技發(fā)展有限公司，型號SH-3；三維平面劃膜儀，上海金標(biāo)生物科技有限公司，型號HM 3030；斬切機(jī)，上海金標(biāo)科技有限公司，型號ZQ2000；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司，型號DRP-9082。

1.2 方法

1.2.1 LPS提取鑒定 使用LPS提取試劑盒提取LPS，同時加蛋白酶K處理，以獲得更高純度；用蒽酮法測定LPS濃度，SDS-PAGE凝膠電泳和銀染試劑盒銀染鑒定LPS，鱟試劑檢測LPS活性。

1.2.2 免疫層析檢測方法建立 通過試驗數(shù)據(jù)和經(jīng)驗，篩選最佳金標(biāo)墊、NC膜、樣品墊、吸水紙、濾血膜、樣品稀釋液，并確定膠體金、膠體金蛋白結(jié)合物、金標(biāo)墊、NC膜、樣品墊等最佳處理方法，以及檢測線和質(zhì)控線最佳包被濃度、最佳奶樣稀釋度、最佳判讀時間。

1.2.3 敏感性檢測 使用本研究建立的布魯氏菌抗體免疫層析方法檢測50份布魯氏菌陽性牛奶樣，計算陽性檢出率，同時對10份布魯氏菌陽性牛奶樣進(jìn)行1∶2～1∶32連續(xù)倍比稀釋后測定效價，并與全乳環(huán)狀試驗進(jìn)行比較。

1.2.4 特異性檢測 使用本研究建立的布魯氏菌抗體免疫層析方法檢測50份布魯氏菌陰性牛奶樣，計算陰性檢出率，同時檢測口蹄疫O型陽性牛奶樣、口蹄疫A型陽性牛奶樣、口蹄疫亞洲Ⅰ型陽性牛奶樣、牛副傷寒病陽性牛奶樣各2份，判斷是否有交叉反應(yīng)。

1.2.5 重復(fù)性檢測 按照建立的布魯氏菌抗體免疫層析方法，制備3批檢測試紙條，批號設(shè)為201801、201802、201803。使用3批試紙條檢測布魯氏菌陰陽性牛奶樣各5份，計算批間重復(fù)性；使用3盒201801批檢測試紙條檢測上述樣品，計算批內(nèi)重復(fù)性。

1.2.6 保存期檢測 將3個批次的試紙條置于37 ℃的保存條件下，放置18 d，分別在0、1、2、3、6、12、15、18 d，對其性狀、裝量、無菌、敏感性和特異性進(jìn)行檢驗，通過加速試驗確定產(chǎn)品保存期。

1.2.7 符合率檢測 將臨床采集的262份樣本，分別用建立的奶樣檢測試紙條、全乳環(huán)狀試驗、ELISA方法（SVANOVA、IDEXX）進(jìn)行驗證，篩選血清學(xué)檢測結(jié)果均為陰、陽性的牛奶樣，進(jìn)行符合率驗證。

2 結(jié)果

2.1 LPS提取鑒定

使用LPS提取試劑盒提取LPS后，用蒽酮法測定LPS濃度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得LPS平均濃度為1.26 mg/mL（圖1）；SDS-PAGE凝膠電泳顯示無明顯蛋白條帶（圖2），SDS-PAGE凝膠銀染可見蛋白條帶（圖3）；利用鱟試劑檢測試劑盒提取LPS并檢測其活性，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得鱟試劑凝集活性為256.56±0.08（圖4）。LPS濃度、純度驗證表明，制備的LPS質(zhì)量良好，可用于后續(xù)檢測試紙條免疫層析方法的建立。

圖1 蒽酮法檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果

圖3 LPS銀染結(jié)果

圖4 鱟試劑檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 免疫層析檢測方法建立

根據(jù)試紙條的顯色情況、擴(kuò)散情況，最終確定奶樣中布魯氏菌抗體免疫層析檢測的最佳方法和參數(shù)如下：膠體金制備加入氯金酸后，加檸檬酸三鈉，轉(zhuǎn)速600 r/min加熱15 min；膠體金蛋白結(jié)合物制備標(biāo)記pH為6.0，加入的SPA量為6 μL，封閉液為20% BSA，復(fù)溶液選擇含有10%蔗糖、1%BSA和0.5% PVP-40的0.01 mol/L Tris-HCl溶液，標(biāo)記、封閉、純化時間均為30 min；金標(biāo)墊和樣品墊均選擇上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的玻璃纖維膜，最佳干燥條件為37 ℃烘干16 h；NC膜型號選擇CN140，最佳干燥條件為37 ℃烘干16 h；吸水紙選擇上海良信生物技術(shù)有限公司的CH 27號產(chǎn)品；濾血膜選擇Cobetter HD（1.8 μm）；檢測線上LPS最佳包被濃度為1.0 mg/mL，質(zhì)控線上雞抗SPA最佳包被濃度為1.0 mg/mL，奶樣最佳稀釋倍數(shù)為1∶3，最佳判讀時間為10～15 min。

2.3 敏感性檢測

使用建立的布魯氏菌抗體免疫層析方法，檢測50份布魯氏菌陽性牛奶樣，發(fā)現(xiàn)其中49份為陽性，敏感性為98.0%（49/50）。10份布魯氏菌陽性牛奶樣經(jīng)1∶2～1∶32連續(xù)倍比稀釋后檢測效價為1∶2～1∶8，均高于同等稀倍數(shù)下全乳環(huán)狀試驗（表1）。

2.4 特異性檢測

使用本研究建立的布魯氏菌抗體免疫層析方法，檢測50份布魯氏菌陰性牛奶樣，發(fā)現(xiàn)48份為陰性，特異性為96.0%（48/50），口蹄疫O型陽性牛奶樣、口蹄疫A型陽性牛奶樣、口蹄疫亞洲Ⅰ型陽性牛奶樣、牛副傷寒病陽性牛奶樣檢測結(jié)果均為陰性（表2）。

表1 抗體效價檢測結(jié)果

表2 交叉反應(yīng)檢測結(jié)果

2.5 重復(fù)性檢測

使用3批檢測試紙條（201801、201802、201803）檢測布魯氏菌陰陽性牛奶樣各5份，發(fā)現(xiàn)3批檢測結(jié)果100%符合（表3）；使用3盒201801批檢測試紙條檢測上述樣品，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果100%符合（表4）。上述結(jié)果說明，該試紙條批間、批內(nèi)重復(fù)性均良好。

2.6 保存期檢測

在37 ℃保存條件下，使用檢測試紙條分別在0、1、2、3、6、12、15、18 d，對其性狀、裝量、無菌、敏感性和特異性進(jìn)行檢驗。檢驗結(jié)果顯示，37 ℃放置15 d后，檢測試紙條性狀、裝量、無菌、敏感性和特異性均符合要求，放置18 d后，試紙條敏感性、特異性有所下降。根據(jù)加速保存期試驗檢測結(jié)果，將試紙條保存期定為2～30 ℃條件下保存12個月。

2.7 符合率檢測

使用本研究的奶樣檢測試紙條、全乳環(huán)狀試驗、ELISA方法（SVANOVA，IDEXX）分別檢測臨床采集的262份牛奶樣，發(fā)現(xiàn)66份牛奶樣血清學(xué)檢測（SVANOVA，IDEXX和檢測試紙條）均為陽性，33份均為陰性（表5）。以篩選出的99份牛奶樣為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行符合率驗證，發(fā)現(xiàn)檢測試紙條的陽性符合率為95.5%，陰性符合率為93.9%，總符合率為94.9%（表6）。

表3 批間重復(fù)性檢測結(jié)果

表4 批內(nèi)重復(fù)性檢測結(jié)果

表5 不同檢測方法檢測結(jié)果

表6 不同檢測方法與標(biāo)準(zhǔn)奶樣的符合率檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本研究建立的檢測試紙條敏感性為98.0%，倍比稀釋檢測抗體滴度為 1∶2～1∶8， 特異性為96.0%，檢測試紙條與口蹄疫O型陽性奶樣、口蹄疫A型陽性奶樣、口蹄疫亞洲I型陽性奶樣、牛副傷寒病陽性奶樣均無交叉反應(yīng)；對檢測試紙條進(jìn)行重復(fù)性檢測，發(fā)現(xiàn)批間、批內(nèi)重復(fù)性均良好；通過保存期加速試驗，檢測試紙條保存期暫定為2～30 ℃保存12個月。通過與國標(biāo)方法與ELISA方法篩選標(biāo)準(zhǔn)奶樣進(jìn)行符合率檢測，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)奶樣的總符合率為94.9%。符合率驗證結(jié)果顯示：國標(biāo)方法特異性好，但是敏感性低，不適用于布病初篩；SVANOVA試劑盒檢測奶樣，特異性較差，假陽性較高，會導(dǎo)致健康奶牛淘汰，增加飼養(yǎng)成本；IDEXX試劑盒敏感性、特異性較好，但相比檢測試紙條檢測時間較長，設(shè)備要求高。

綜上所述，本研究建立的檢測奶樣的布魯氏菌抗體酶聯(lián)免疫方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)以及方便、快捷等優(yōu)點，適用于現(xiàn)場大批量檢測，可應(yīng)用于奶牛場的布病初篩。該方法的建立為我國布防控提供了技術(shù)支持。