張澤宇 ，蘇 扣 ，王 瑞 ，霍乃蕊 ，趙思俊

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；3. 天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；4. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥 230036）

β-受體激動劑常被非法添加到飼料中，用以促進(jìn)動物生長和提高瘦肉率。人攝入過多含有β-受體激動劑殘留的動物性食品，可引起肌肉震顫、腹痛、惡心、心動過速、心率加快等中毒癥狀，嚴(yán)重者危及生命[1]。我國早在2002年就明確，在食品動物生產(chǎn)中，禁用克倫特羅（Clenbuterol，CLE）、沙丁胺醇、萊克多巴胺等β-受體激動劑類藥物[2]，并規(guī)定在所有可食用動物組織中均不得檢出[3-5]。近年來，隨著對上述藥物監(jiān)管力度的加強(qiáng)，溴氯特羅、馬布特羅、溴布特羅、苯乙醇胺A等克倫特羅的同系物在動物養(yǎng)殖、運(yùn)輸和屠宰環(huán)節(jié)都有不同程度的檢出[7]。

為了更好地監(jiān)管β-受體激動劑在食品動物生產(chǎn)中的違法使用，國內(nèi)外科研人員對檢測方法進(jìn)行了深入研究。常用的β-受體激動劑檢測方法主要有儀器測定法、免疫快速測定法等[8]。前者如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法等[9-11]檢測結(jié)果可靠，但設(shè)備昂貴，檢測過程繁瑣[12]。而ELISA等免疫測定法由于特異性強(qiáng)、操作簡單、快速，且檢測成本低，被廣泛應(yīng)用于大批量樣品的篩查和基層監(jiān)管工作中[13-14]。

本文作者在開展ELISA檢測過程中，對不同保存時間的豬尿液進(jìn)行ELISA測定時發(fā)現(xiàn)，對冷凍保存半年的豬尿液進(jìn)行添加回收測試時的藥物回收率高達(dá)330.00%～5 173.25%，檢測限達(dá)58.8 ng/mL；而以新鮮尿液進(jìn)行添加回收試驗(yàn)的樣品回收率在65.00%～118.00%之間，檢測限為0.8 ng/mL，檢測參數(shù)均在獸藥殘留檢測方法允許的范圍內(nèi)。

為此，本研究以新鮮豬尿液、冷凍保存半年以上的豬尿液樣品為研究對象，采取不同的樣品前處理方法，對應(yīng)用間接競爭ELISA方法測定豬尿液中克倫特羅等β-受體激動劑藥物進(jìn)行了較為詳細(xì)的比較研究，以提高檢測的靈敏度、準(zhǔn)確性，并考察所用單抗與克倫特羅結(jié)構(gòu)類似藥物的交叉反應(yīng)性，為準(zhǔn)確度高、適用性強(qiáng)的克倫特羅快檢試劑盒研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自山東省某養(yǎng)豬場采集的新鮮豬尿5份和本實(shí)驗(yàn)室冷凍儲存半年以上的豬尿5份（均經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證檢測為克倫特羅等β-受體激動劑陰性），分成若干份儲存在-20 ℃冰箱內(nèi)?？藗愄亓_、溴氯特羅、馬布特羅、溴布特羅、沙丁胺醇、異克倫潘特、克倫塞羅、班布特羅、特布他林、噴布特羅、吡布特羅等標(biāo)準(zhǔn)品：購于Dr. Ehrensorfer公司；牛血清白蛋白（BSA，99.9%）、兔抗鼠IgG-HRP、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：購于美國Sigma-Aldrich公司。

克倫特羅包被抗原（CLE-OVA）：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家獸藥安全評價(jià)中心饋贈；克倫特羅單克隆抗體（1F8B10B7）：購于英國Abcam公司。包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液（CBS，pH9.6，0.05 mol/L），磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4，0.01 mol/L）；洗滌液：含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（PBST，pH7.4，0.01 mol/L）；封閉液：含1% BSA的PBST；顯色液：TMB的醋酸-檸檬酸緩沖液；終止液：2 mol/L硫酸溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

MCX SPE小柱：購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司產(chǎn)品，型號5804R；氮吹儀：美國Organomation公司產(chǎn)品；In fi niteF50酶標(biāo)儀：瑞士TECAN公司產(chǎn)品；酶標(biāo)板：型號為42592，購于美國Corning公司。

1.3 方法

1.3.1 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度測定 將酶標(biāo)二抗按 1∶1 000～1∶400 000 進(jìn)行 7 個濃度稀釋，每個濃度3孔平行，加入96孔酶標(biāo)板中，80 μL/孔，孵育1 h后加1% BSA封閉2 h，然后加TMB底物顯色液100 μL/孔，室溫避光孵育15 min，每孔加終止液（50 μL/孔）終止反應(yīng)，在波長450 nm處測OD值。

1.3.2 間接競爭ELISA操作 將包被抗原（CLEOVA）加入96孔酶標(biāo)板中，80 μL/孔，孵育1 h后加1% BSA封閉2 h，每孔加50 μL樣品/標(biāo)準(zhǔn)溶液和CLE單抗，孵育1 h后，加稀釋后的兔抗鼠 IgG-HRP，50 μL/孔，孵育 1 h，然后加 TMB底物顯色液100 μL/孔，室溫避光孵育15 min，每孔加終止液（50 μL/孔）終止反應(yīng)，在波長450 nm處測OD值。上述操作中，包被、封閉和抗原抗體反應(yīng)均在37 ℃避光孵育，每次反應(yīng)后均用PBST溶液洗滌4次。

1.3.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和IC50計(jì)算 將CLE標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成 0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3 ng/mL，將單克隆抗體稀釋至1.3.1確定的最佳工作濃度，封閉后每反應(yīng)孔內(nèi)加入CLE標(biāo)品溶液和CLE單抗各40 μL。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，每孔中標(biāo)準(zhǔn)品的終濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用軟件Ridasoft.win計(jì)算IC50。

1.3.4 SPE凈化處理 取豬尿樣品2 mL，加入1 mL 0.1%甲酸水溶液后，加入經(jīng)3 mL甲醇和3 mL水活化的MCX小柱，分別用3 mL水、3 mL甲醇淋洗小柱，再用抽濾器抽干小柱；最后用3 mL 5%氨化甲醇洗脫小柱，收集洗脫液，50 ℃氮?dú)獯蹈珊?，加? mL磷酸鹽溶液復(fù)溶，備用。

1.3.5 加標(biāo)回收試驗(yàn) 分別取適量的新鮮豬尿和冷凍儲存半年的豬尿液（n=5），直接上樣或經(jīng)MCX小柱凈化處理后上樣，利用間接競爭ELISA法進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。

1.3.6 檢測限測定 依據(jù)Liu等[21]和Barreiro等[22]的方法，各取新鮮豬尿和冷凍儲存半年以上的豬尿40份，其中20份經(jīng)MCX小柱凈化處理后使用，另外20份尿液直接利用間接競爭ELISA，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將各樣品OD值轉(zhuǎn)化為濃度（ng/mL）。

1.3.7 交叉反應(yīng)率 將與克倫特羅結(jié)構(gòu)相似的溴布特羅等藥物作系列稀釋[26-28]，按1.3.2進(jìn)行操作，繪制各藥品的濃度-抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各結(jié)構(gòu)相似藥物的IC50值，計(jì)算交叉反應(yīng)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA反應(yīng)條件優(yōu)化

CLE-OVA抗原及CLE單抗的最適作用濃度：不同濃度抗原和抗體的陣列間接ELISA反應(yīng)結(jié)果如表1所示。 由表1可見，OD值≥1且最接近于1，P/N值≥2.1，故確定這兩個稀釋度為最佳工作濃度并用于后續(xù)間接競爭ELISA分析。選擇OD值接近1是為了便于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和IC50計(jì)算。

經(jīng)間接ELISA反應(yīng)條件優(yōu)化，確定包被抗原濃度為1∶40 000，抗體濃度為1∶20 000，封閉液為1%，封閉時間1 h最佳，抗體最佳作用時間為60 min，酶標(biāo)二抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶50 000，酶標(biāo)二抗最佳作用時間為60 min，底物顯色時間為15 min。

表1 不同濃度CLE-OVA抗原及CLE單抗的間接ELISA OD450測定結(jié)果

2.2 CLE的IC-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

以7個濃度的CLE標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行IC-ELISA反應(yīng)，經(jīng)Logistics函數(shù)的四參數(shù)方程擬合，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）的線性范圍為0.016～8.520 ng/mL，IC50值為0.57 ng/mL。

圖1 克倫特羅IC-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 檢測限

從圖2可以看出，冷凍儲存超過半年的5份豬尿（共20份）經(jīng)過MCX小柱SPE處理后，經(jīng)IC-ELISA測試，反應(yīng)孔顯色較未經(jīng)SPE凈化處理組的顏色更深一些，OD450nm值顯著高于未經(jīng)SPE凈化組。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出每個反應(yīng)孔相對應(yīng)的CLE濃度（圖3），未凈化處理的20份陰性豬尿，CLE濃度平均值為（47.37±3.83）ng/mL，LOD 為 58.85 ng/mL。經(jīng)MCX凈化后的20份陰性豬尿CLE濃度平均值為（0.03±0.02）ng/mL，LOD為0.08 ng/mL； 凈化和未凈化的檢測限相差730余倍，極易造成ELISA檢測中出現(xiàn)誤判的情況。

2.4 加標(biāo)回收率

圖2 經(jīng)SPE凈化和未凈化的40份空白豬尿OD值

圖3 經(jīng)SPE凈化和未凈化的40份空白豬尿測定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，冷凍保存的豬尿液不經(jīng)MCX小柱凈化處理直接進(jìn)行ELISA檢測，在添加濃度為0.9、2.7、8.1 ng/mL時，回收率為85.19%～5173.25%，變異系數(shù)為4.78%～96.79%；且添加濃度越低，回收率越高，實(shí)測濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于添加濃度，所以易于造成假陽性結(jié)果；而經(jīng)MCX柱處理后，相同的添加濃度，藥物回收率在101.21%～119.10%之間，變異系數(shù)為6.05%～18.38%，符合獸藥殘留酶聯(lián)免疫分析的要求，能夠滿足ELISA在開展日常快速檢測的需要。

2.5 新鮮豬尿液測定

此外，本試驗(yàn)還對采集的新鮮豬尿液進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)新鮮豬尿液樣品不經(jīng)MCX柱凈化直接進(jìn)行ELISA測定的檢測限為0.09 ng/mL，與冷凍保存半年以上豬尿液經(jīng)MCX柱凈化后的結(jié)果無明顯差別。在添加濃度為0.9、2.7、8.1 ng/mL時，回收率為60.47%～124.47%，變異系數(shù)為8.15%～19.46%。

2.6 交叉反應(yīng)率

如表2顯示，溴氯特羅、馬布特羅、溴布特羅等3種藥物與克倫特羅交叉反應(yīng)明顯，交叉反應(yīng)率分別為80.0%、57.1%和38.1%，而沙丁胺醇、異克倫潘特、克倫塞羅、班布特羅、特布他林、噴布特羅、吡布特羅等7種藥物的交叉反應(yīng)率均低于1.0%。

3 討論

3.1 ELISA反應(yīng)條件優(yōu)化

表2 克倫特羅與10種結(jié)構(gòu)類似藥物的交叉反應(yīng)率

ELISA反應(yīng)條件，如包被抗原的濃度、抗體稀釋倍數(shù)、反應(yīng)時間等都會影響ELISA的檢測結(jié)果?？乖陌粷舛群涂贵w的工作濃度是影響ELISA反應(yīng)的重要因素之一，濃度過高和過低都不合適。本試驗(yàn)采用方陣法對反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定包被溫度37 ℃，包被時間為1 h，競爭時間為0.5 h，包被抗原稀釋倍數(shù)為1∶40 000，抗體稀釋倍數(shù)為1∶20 000，封閉液為1% BSA。以此條件建立克倫特羅間接競爭ELISA檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，IC50為0.57 ng/mL。

3.2 ELISA特異性

ELISA檢測方法的特異性主要取決于抗體是否對特定分析物表現(xiàn)出高度的特異性。本研究結(jié)果表明，所選用的克倫特羅抗體對克倫特羅及其同系物溴氯特羅、馬布特羅和溴布特羅有交叉反應(yīng)性，從分子結(jié)構(gòu)式（表2）可以看出，這4種藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相似，僅在苯環(huán)上的取代鹵素基團(tuán)不同。4種藥物在苯環(huán)左側(cè)均含有間位-NH2基團(tuán)，-NH2基團(tuán)鄰位均含有-Cl、-Br等鹵素基團(tuán)，且烴基鏈均含有叔丁基；而本試驗(yàn)中測試的其余7種交叉反應(yīng)不明顯的藥物只滿足上述一種條件。一種情況為左側(cè)有鹵素基團(tuán)，但右側(cè)無叔丁基，另一種情況與之相反。進(jìn)一步表明，本試驗(yàn)所用抗體的特異性較強(qiáng)，抗原抗體的識別位點(diǎn)包括分子結(jié)構(gòu)式中左側(cè)苯環(huán)上的基團(tuán)和右側(cè)叔丁基基團(tuán)；利用該抗體建立的ELISA方法，可針對克倫特羅、溴氯特羅、馬布特羅和溴布特羅等結(jié)構(gòu)同系物。

3.3 不同處理方法對ELISA檢測豬尿樣品的影響

本研究以新鮮豬尿液和冷凍保存半年以上的豬尿液為研究對象，分別采用直接ELISA測定和經(jīng)MCX小柱凈化處理后進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新鮮豬尿液凈化與否，對ELISA測定的準(zhǔn)確度、精密度和檢測限無明顯影響；而對于冷凍時間較長的尿液，解凍后呈深黃色混濁液體，可能由于尿液中色素和蛋白等基質(zhì)在長期保存過程中發(fā)生一些變化，從而導(dǎo)致ELISA測定時基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，藥物的準(zhǔn)確度、精密度、檢測限（回收率為85.19%～5173.25%，變異系數(shù)為4.78%～96.79%，而LOD達(dá)58.85 ng/mL）均有較大變化，直接影響ELISA檢測的準(zhǔn)確度；而經(jīng)MCX小柱凈化處理后，豬尿液樣品中的雜質(zhì)被有效去除，添加回收試驗(yàn)結(jié)果也顯示，藥物回收率為101.21%～119.10%，變異系數(shù)為6.05%～18.38%，LOD為0.076 ng/mL。由此可見，為了避免ELISA檢測假陽性的出現(xiàn)，提高IC-ELISA的靈敏度，對豬尿樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚硎潜匦璧?。在ELISA檢測時，如果尿液渾濁，通常要對豬尿樣品采用過濾或離心的方式進(jìn)行處理，但尿液成分復(fù)雜，而且經(jīng)過較長時間儲存后，尿液中色素、金屬離子等雜質(zhì)可能會發(fā)生一些變化，從而在ELISA測試中干擾抗原、抗體之間的反應(yīng)，直接影響試驗(yàn)結(jié)果的可靠性[29-30]。

本試驗(yàn)采用MCX混合陽離子型固相萃取小柱，通過洗滌、洗脫等步驟，可有效去除豬尿中的色素、蛋白質(zhì)、鹽等雜質(zhì)，從而減少對抗體的生物活性影響，使抗體與包被抗原或待測物的結(jié)合更為緊密，從而大大提高了ELISA檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度，使各項(xiàng)檢測參數(shù)（回收率、變異系數(shù)、檢測限等）均符合免疫殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)[31-32]，為今后開展ELISA快速篩查過程中避免出現(xiàn)假陽性而造成的誤判提供了可靠的技術(shù)支撐。