宋前進，杭天宇，烏東高娃，李伊銘，關(guān)平原，溫永俊

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌[1-2]，抵抗力較強，在土壤、毛皮、病畜的臟器及其分泌物中可生存數(shù)周至數(shù)月[3]。該病原體主要寄生于人或動物的巨噬細胞內(nèi)，有逃避先天性免疫的能力[4]。布魯氏菌病是一種重大的人獸共患傳染病[5]，人類患病后表現(xiàn)為布氏熱、關(guān)節(jié)炎等癥狀，且較難恢復；家畜患病后主要引起母畜流產(chǎn),也可引起乳腺炎、子宮炎、睪丸炎等癥狀[6]。該病給人類健康及畜牧業(yè)發(fā)展造成嚴重威脅[7]。

反芻動物和豬對布魯氏菌高度易感。布魯氏菌特征性地侵害其生殖器官并導致母畜流產(chǎn)和不孕。當患病母畜分娩時，胎盤組織中布魯氏菌達到極高數(shù)量，每克組織中細菌數(shù)可高達1014個，因此母畜流產(chǎn)是該病的傳染性病癥[8]。據(jù)資料[9]報道，這種趨向性和廣泛繁殖與易感動物生殖器官中的高赤蘚糖醇濃度有關(guān)。布魯菌特征性地侵害宿主的生殖器官并導致母畜流產(chǎn)和不孕，其主要是因為赤鮮糖醇是由懷孕動物胎盤組織產(chǎn)生的，可作為一種生長劑和碳源促進布魯菌在體內(nèi)的增殖[10]，并會誘發(fā)炎癥細胞浸潤、滋養(yǎng)層細胞壞死及先導性血管炎[11]。因此最終導致胎兒-母體代謝交換受損，導致胎兒流產(chǎn)[12]。Mukherjee等[13]通過體內(nèi)試驗觀察到，非腸道注射赤蘚糖醇會增加腹膜感染小牛脾臟中布魯氏菌數(shù)量。Sangari等[14]對B.abortus 2308株赤蘚糖醇基因的研究顯示，該基因全序列有7 714 bp，操縱子、啟動子位于5′-ery A并含IHF（整合宿主因子）結(jié)合點，eryA影響整個基因的轉(zhuǎn)錄表達。吳冬玲等[13]對布魯氏菌S19和A19基因進行序列比對及克隆測序，證實S19缺失的702 bp基因序列位于eryC和eryD之間。目前，赤蘚糖醇基因被認為是布魯氏菌感染的主要因素之一，有很大的研究價值。

為此，本試驗通過對布魯氏菌赤蘚糖醇基因eryA的克隆、表達、純化及生物信息學分析，探索該基因編碼蛋白的免疫原性，以期為布魯氏菌診斷方法及iELISA診斷試劑盒的建立提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑 羊種布魯氏菌Rev.I株：由金宇寶林有限公司提供；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株、BL21（DE3）菌株及pET-30a 載體：由本實驗室保存；DNA Marker：購自大連寶生物工程有限公司；T4連接酶：購自NEB公司；限制性內(nèi)切酶（EcoRI/XhoI）、2×Es TaqMasterMix、細菌質(zhì)粒小提取試劑盒以及瓊脂糖凝膠回收試劑盒：購自Thermo Fisher Scientific公司；HRP標記的兔抗羊IgG抗體：購自Abcom公司；蛋白Marker：購自北京全式金公司；顯色劑：購自碧云天生物公司。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺、PCR儀、制冰機、超速離心機、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、高速冷凍離心機、超聲波細胞粉碎機、水浴鍋、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀、蛋白純化儀等。

1.2 方法

1.2.1 目的基因擴增 將羊種布魯氏菌Rev.I株滅活菌液（水浴鍋中85 ℃滅活1 h），按細菌DNA提取試劑盒操作步驟進行菌體DNA提取。根據(jù)GenBank中登錄的布魯氏菌U57100 ery基因序列中eryA基因設計引物（表1），并由北京華大基因有限公司合成。目的基因PCR擴增采用25 μL反應體系：Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、上游引物1 μL、下游引物 1 μL、DNA 模板 1 μL。反應條件為：95 ℃變性3 min；94 ℃變性45 s，35個循環(huán)，55 ℃ 退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，最后 72 ℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物用2 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測?；厥漳康幕蚱危瑢⑵渑cpMD19-T載體在16 ℃條件下連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-eryA。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，并在氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上進行陽性篩選，然后進行菌液PCR并送往北京華大有限公司進行測序鑒定，將測序結(jié)果在GenBank中進行比對。

表1 eryA基因引物序列

1.2.2 原核表達載體構(gòu)建 將送公司測序正確的質(zhì)粒pMD19-T-eryA和pET-30a載體用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段和酶切后的線性pET-30a載體。將回收的產(chǎn)物按一定摩爾比在16 ℃金屬浴中過夜連接，后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，涂布于卡那抗性平板培養(yǎng)12～16 h，對陽性克隆進行搖菌提取質(zhì)粒，并進行菌液RCR檢測及質(zhì)粒雙酶切鑒定。

1.2.3 重組蛋白SDS-PAGE電泳檢測 從轉(zhuǎn)化的平板上，挑單克隆到15 mL含相應抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD=0.6～0.8，用 0.5 mmol/L的 IPTG，37 ℃，200 r/min誘 導培養(yǎng)2 h；取1 mL誘導菌液，12 000 r/min，離心1 min，棄上清；將沉淀用 10 mmol/L Tris-HCl pH8.0溶液吹散，將等體積的緩沖液及2×loading buffer加入到1.5 mL離心管中，100 ℃煮10 min；SDS-PAGE電泳檢測后，按照1∶50比例接菌到卡那抗性的 LB液體培養(yǎng)基中進行誘導表達。

1.2.4 重組蛋白純化 用去離子水洗鎳柱（Ni Sepharose 6 Fast Flow，GE Healthcare）至 pH7.0；掛鎳至pH2.0～pH3.0，再用去離子水洗鎳柱至pH7.0；用約100 mL的10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液平衡鎳柱，再用約50 mL含8 mol/L尿素、0.5 mol/L氯化鈉、10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液平衡鎳柱，最后用含8 mol/L尿素、0.5 mol/L氯化鈉、10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液對樣品稀釋上樣；上樣結(jié)束后，用含8 mol/L尿素、0.5 mol/L氯化鈉、10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液洗柱，再分別用含15、60、500 mmol/L咪唑和10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液洗脫，分別收集蛋白峰，然后電泳檢測蛋白純化效果。

1.2.5 重組蛋白Western-blot檢測 對純化蛋白進行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，14 V電壓電轉(zhuǎn)50 min；將膜放入預先用PBST緩沖液洗滌后的平皿，用1%的脫脂乳4 ℃過夜封閉，用PBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次15 min；加入1∶500稀釋的，經(jīng)本實驗室用虎紅平板凝集試驗鑒定的羊種布魯氏菌陽性血清，37 ℃孵育4 h；用PBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次15 min，然后加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化氫酶標記的兔抗羊IgG抗體，37 ℃孵育2 h；PBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次15 min，后用顯色劑顯色后拍照。

1.3 生物信息學分析

利用TMHMM Serverv.2.0在線軟件預測eryA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，利用SignalP 4.1 Server在線軟件預測eryA蛋白的信號肽；通過SOPMA在線軟件分析eryA蛋白的二級結(jié)構(gòu)，通過Phyre2在線服務器預測eryA蛋白的三級結(jié)構(gòu)，利用Predicting Antigenic Peptides在線軟件預測eryA蛋白的抗原決定簇。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段擴增及原核質(zhì)粒構(gòu)建

羊種布魯氏菌的eryA基因片段大小為1 563 bp，PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，與預期大小一致（圖1）。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI對質(zhì)粒pET-30a及目的片段進行雙酶切后，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果與預期條帶相符（圖2）。

2.2 重組蛋白SDS-PAGE電泳檢測

處理破碎的樣品，然后加入與緩沖液等體積的 2×loading buffer，100 ℃煮 5 min，電泳檢測，結(jié)果如圖3、圖4。SDS-PAGE 分析顯示，eryA基因在63 kD處有明顯條帶，主要表達在沉淀中，且大小與預期結(jié)果一致。

圖1 PCR擴增或膠回收產(chǎn)物

圖2 雙酶切PCR回收產(chǎn)物和pET30a載體

圖3 SDS-PAGE檢測蛋白表達

2.3 蛋白質(zhì)純化

對沉淀樣品分別用含15、60、500 mmol/L咪唑 和 10 mmmol/L Tris-HCl（pH8.0， 含 8 mmol/L尿素、0.5 mmol/L氯化鈉）溶液洗脫，分別收集蛋白峰，電泳檢測蛋白純化效果，結(jié)果純化出相應的蛋白（圖5）。圖6為純化后的SDS-PAGE膠圖。

圖4 SDS-PAGE電泳分析蛋白在沉淀中表達

圖5 目的蛋白純化后SDS-PAGE電泳圖

圖6 純化后SDS-PAGE電泳圖

2.4 Western-Blot檢測

對誘導8 h后的重組蛋白純化后進行Westernblot檢測，14 V電壓下轉(zhuǎn)膜50 min，孵育羊布魯氏菌陽性血清，可見明顯的目的條帶，說明誘導得到的重組蛋白能被HRP標記的羊抗鼠IgG抗體識別，且大小與 pET-30a分子質(zhì)量加上目標分子蛋白質(zhì)量的重組蛋白總分子質(zhì)量相符（圖7）。

圖7 Western-blot檢測結(jié)果

2.5 目的蛋白生物信息學分析

通過TMHMM Serverv.2.0在線軟件，分析羊種布魯氏菌的eryA蛋白氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白無跨膜區(qū)（圖8）；利用SignalP 4.1 Server在線軟件預測羊種布魯氏菌的eryA蛋白的信號肽，發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號肽（圖9）；利用Predicting Antigenic Peptides在線軟件，預測羊種布魯氏菌的eryA蛋白的抗原決定簇，發(fā)現(xiàn)該蛋白共有21個抗原決定簇（圖10）。

圖8 跨膜區(qū)預測

圖9 信號肽預測

經(jīng)SOPMA在線軟件分析得出，該蛋白中參與形成 α-螺旋的氨基酸有233個，占比為44.81%；參與無規(guī)卷曲的結(jié)構(gòu)的氨基酸有174個，占比為33.46%；參與延伸鏈形成的氨基酸有75個，占比為14.42%；參與β-轉(zhuǎn)角形成的氨基酸有38個，占比為11.51%（圖11）。蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)含多種二級結(jié)構(gòu)單元且有明顯的折疊層次。通過在線軟件Swiss Model預測該蛋白的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其三級結(jié)構(gòu)中有大量的α-螺旋及相應的無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，這對該蛋白的穩(wěn)定起重要作用（圖12）。

3 討論

圖10 抗原位點預測

圖11 eryA蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

布魯氏菌病流行范圍廣，對全球反芻動物和豬的養(yǎng)殖帶來了巨大經(jīng)濟損失。我國各?。ㄊ小^(qū)）均有不同程度的人畜布魯氏菌病流行，其防制、檢測及凈化是現(xiàn)階段關(guān)注的重要問題。布魯氏菌有5個經(jīng)典種，基因組同源性較高，但不同株之間的毒力差異較顯著，這給其臨床診斷及疫苗防治造成了不利影響，因此探索對布魯氏菌檢測及疫苗的創(chuàng)新研究很有必要。eryA基因作為布魯氏菌的重要毒力基因之一，有很大的研究價值。有研究發(fā)現(xiàn)，人患布魯氏菌病后的流產(chǎn)現(xiàn)象較動物自然流產(chǎn)更少，這可能是因為人的胎盤和胎兒中不存在赤蘚糖醇[14]，其相關(guān)機制有待研究。Smith等[15]對患布魯氏菌病動物不同臟器中的赤鮮糖醇含量進行了測定，發(fā)現(xiàn)胎盤和胎兒中赤蘚糖醇含量最高，因此懷疑流產(chǎn)可能和赤蘚糖醇含量有關(guān)。Agüero等[16]研究發(fā)現(xiàn)，減毒株S19因缺失赤蘚糖醇的702 bp基因，使其成為唯一受赤蘚糖醇抑制的菌株，其他布魯氏菌均能利用赤蘚糖醇，因此赤蘚糖醇基因在布魯氏菌毒力代謝中起重要作用。Petersen等[17]建立了小鼠赤蘚糖醇位點模型，通過控制細胞內(nèi)外赤蘚糖醇的濃度發(fā)現(xiàn)，若胞外赤蘚糖醇含量高于胞內(nèi)時，細胞外布魯氏菌的含菌量將會升高。因此，需要對赤蘚糖醇基因進行深入研究。

圖12 eryA三級結(jié)構(gòu)預測

本試驗應用生物信息學軟件，對赤蘚糖醇基因eryA進行分析，發(fā)現(xiàn)其編碼的eryA蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，不能進行胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導等生命活動。經(jīng)軟件預測，eryA蛋白沒有信號肽，屬于非分泌型蛋白。eryA蛋白擁有一定數(shù)量的抗原表位，表明eryA蛋白作為抗原能引起良好的免疫應答反應，可以與布魯氏菌病陽性血清抗體發(fā)生特異性結(jié)合，因此既可作為布魯氏菌病診斷抗原，用于ELISA試劑盒建立，也可用于合成肽研究，用于布魯氏菌病檢測及診斷。本研究成功構(gòu)建了eryA蛋白的三維模型。該模型具有一定的可信度，有利于蛋白結(jié)構(gòu)和功能的可視化分析，如大量的α-螺旋結(jié)構(gòu)可將疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，從而增加該蛋白的可溶性?？傊?，布魯氏菌與宿主的相互作用是一個非常復雜的過程。本研究通過構(gòu)建布魯氏菌eryA基因的原核表達載體并對其反應原性進行鑒定以及生物信息學分析，為進一步研究赤蘚糖醇基因在布魯氏菌感染宿主細胞過程中所發(fā)揮的生物學功能提供了依據(jù)。