丁 雪，王 巖，劉麗蓉，肖 肖，鄧洪寬，周曉翠

（1. 山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東淄博 255000；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

布魯氏菌是一類革蘭氏陰性的短小桿菌，家畜中豬、羊、牛對其最易感，可引起母畜傳染性流產(chǎn)。人類主要通過接觸帶菌動物或食用病畜及其相關(guān)乳制品而造成感染[1]，布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q布?。┦鞘澜绶秶鷥?nèi)嚴重危害公共衛(wèi)生安全的人獸共患傳染病之一。目前世界上有170 多個國家和地區(qū)存在布病流行，每年約有50萬的病例，因布病造成的經(jīng)濟損失高達約30億美元[2-3]。近年來，我國家畜養(yǎng)殖量逐年上升，布病的流行范圍逐步擴大，對我國家畜養(yǎng)殖業(yè)和人類健康形成較大威脅。本文結(jié)合2006—2017年我國《獸醫(yī)公報》公布的畜間布病疫情數(shù)據(jù)，對我國布病流行現(xiàn)狀和研究進展展開討論，分析布病流行趨勢，以期為及時調(diào)整布病防控政策，掌握布病分布特征提供參考。

由于布病危害較大，因此感染早期的快速診斷及鑒定對于降低損失意義重大。目前，臨床上的布魯氏菌檢測主要是病原分離，但該方法耗時耗力，且不能做到早期迅速診斷。近幾年，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，特別是生物信息學(xué)、微生物基因組學(xué)的發(fā)展，以多重PCR、熒光定量PCR檢測方法和基因檢測技術(shù)為主的布病檢測技術(shù)，以其操作簡單迅速、高效穩(wěn)定、易于操作等眾多優(yōu)點，成為近些年疫病檢測的研究熱點[4]。此外，各類疫苗的研制以及臨床中西藥物的聯(lián)合使用，更為布病的有效防控開辟了新的途徑。

1 流行狀況

我國畜間布病基本經(jīng)歷了20世紀50～70年代的流行期、80～90年代的基本控制期以及2000年以后的反彈上升期、2010年以后的流行期4個階段[5]。目前，我國動物布病發(fā)病數(shù)量較多的省份有內(nèi)蒙古、新疆、陜西、黑龍江和山西等，其中以內(nèi)蒙古最為嚴重。2011年，內(nèi)蒙古的動物布病發(fā)病數(shù)達到117 623例，占全國動物發(fā)病總數(shù)的94.08%，是我國布病流行最為嚴重的地區(qū)[6]，防控形勢十分嚴峻。

從2006—2017年農(nóng)業(yè)部《獸醫(yī)公報》公布的相關(guān)數(shù)據(jù)（表1）可知，2011年我國畜間病例數(shù)達到了高峰，發(fā)病動物數(shù)量超過10萬頭（只）。2012年后，無論人間還是畜間，雖然患病省份數(shù)量仍維持在較高水平，但畜間病例數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢。

2 布病檢測技術(shù)

2.1 細菌學(xué)檢測

細菌學(xué)方法常用于實驗室檢測中，動物布病病原體可從流產(chǎn)胎兒、胎衣、奶樣和血液中分離，人布病病原體可從血液、骨髓、尿液中分離。不同種屬的布魯氏菌生長狀況存在差異，如牛型布魯氏菌初分離時生長十分緩慢，且對環(huán)境要求較為嚴苛，需有適量的二氧化碳環(huán)境，因此鑒定時間較長，一般2～4周無菌生長，才可判定為陰性。也有報告稱，采用BACTEC9240血培養(yǎng)系統(tǒng)以及骨髓培養(yǎng)可提高布魯氏菌生長速率，縮短檢出時間，但總體來說這種病原分離技術(shù)費時費力，且檢測的準確性不高。

表1 人畜間布病發(fā)病情況統(tǒng)計

2.2 免疫學(xué)檢測

2.2.1 血清凝集試驗 常見的血清凝集試驗有虎紅平板凝集試驗（RBT）和試管凝集試驗（SAT），但二者的特異性和靈敏度都不高，同時也存在人為判定因素影響，在實際操作中應(yīng)用不方便，因而國際貿(mào)易中不主張使用SAT試驗。范偉興等[7]在布魯氏菌檢測試驗中證實，不論RBT還是SAT均有較高的假陽性和假陰性，因此可以先選擇RBT進行初篩，若為陽性，再用cELISA進行確診。楊春萍[8]用RBT和SAT比較布病檢測的陽性率、敏感性及特異性，結(jié)果表明在布病的臨床診斷中，使用RBT、SAT進行檢測均存在一定的局限性?？傊?，在實際應(yīng)用中，應(yīng)綜合采用多種檢測方法對布病進行鑒定，這樣才能提高診斷的準確性。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） ELISA方法是國際貿(mào)易中指定的診斷方法，其特點是快速、特異、靈敏，因而不斷得到推廣應(yīng)用。該方法的靈敏性比凝集試驗高，特異性也很好，既可檢測IgG和IgM，又可檢測IgA類抗體[9]。1976年Carlsson第一次使用間接ELISA法檢測人布病。隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展，現(xiàn)如今牛、羊和豬等多種動物的布病iELISA方法也已經(jīng)被建立[4]。該方法是利用抗原抗體之間的專一性，對抗體進行檢測，可分為：雙抗夾心法，多用于大分子抗原檢測；間接法，常用于抗體檢測；競爭法，常用于小分子抗原檢測。Burriel等[10]對競爭法和間接法進行了比較分析，證明cELISA在實際操作中，能區(qū)分疫苗免疫抗體與病株感染抗體，且特異性、靈敏度都較高。我國學(xué)者杜銳等[11]對3種抗原進行篩選和優(yōu)化，確定了其中之一的超聲波破碎抗原為最佳的抗原，第一次建立了檢測鹿布魯氏菌抗體的間接ELISA；2003年張喜悅等[12]建立的牛布魯氏菌ELISA方法，將熱酚法提取的脂多糖（LPS）作為抗原，且試驗證實效果良好，可特異性的檢測布魯氏菌；2009年趙偉棟等[13]用大腸桿菌表達的牛布魯氏菌重組BP26蛋白作為檢測抗原，包被抗原和待檢血清的最佳條件通過棋盤滴定法來測定，建立了效果較好的間接ELISA方法，將該方法與普通常見的試管凝集試驗進行結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)符合率為93.3%；2010年宮曉煒等[14]也建立了間接ELISA方法，在其研究中將原核表達并純化的布魯氏菌周質(zhì)蛋白BP26作為包被抗原，用來檢測牛血清的陽性率，發(fā)現(xiàn)符合率可達到93.0%；2011年高宇哲等[15]以大腸桿菌重組表達的VirB12蛋白作為檢測抗原（該蛋白可作為檢測布魯氏菌的一種特異標識），這為布病檢測提供了新思路；2015年王志明[16]將Brucella-5C10作為競爭抗體，利用牛種布魯氏菌A99作為抗原包被酶標板，HRP標記的羊抗鼠IgG為第二抗體，組建了cELISA試劑盒，該試劑盒具有良好的特異性和靈敏度，能夠更好地排除由某些菌造成的假陽性現(xiàn)象。近些年來，ELISA方法因其特異性好等優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用。陳昌海等[17]利用酶聯(lián)免疫儀進行樣品判定，判定時樣品的需要量僅2 μL，整個反應(yīng)僅需1.5 h，這樣極大程度地避免了人為因素干擾，從而使布魯氏菌檢測更加快速、準確。

2.2.3 補體結(jié)合試驗（CFT）、免疫熒光試驗和膠體金免疫層析技術(shù) CFT特異性強，但操作較其他方法復(fù)雜，且陽性出現(xiàn)時間較晚，在人醫(yī)上僅用于診斷比較困難的人群。由于條件要求較苛刻，在普通獸醫(yī)站難以進行，所以實際應(yīng)用并不廣泛，因此與ELISA相比，大多數(shù)研究人員多采用后者。早在1986年，魏濤等[18]將免疫熒光抗體試驗成功應(yīng)用于布魯氏菌抗原檢測。布魯氏菌結(jié)合熒光抗體后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)明亮的特異性細菌熒光，具有屬的特異性，但不能區(qū)別牛、羊、豬等生物物種。免疫磁性分離技術(shù)（IMBS）是將免疫學(xué)反應(yīng)與磁珠特有的磁響應(yīng)性相結(jié)合的一種新興免疫學(xué)技術(shù)[19]，近年來在國內(nèi)外也成為一個研究熱點。2016年苗玉強[20]研究了布魯氏菌免疫磁珠及免疫熒光檢測方法，闡明了免疫磁性分離技術(shù)可以高效收集、濃縮大量樣品中的少量病原微生物，而間接免疫熒光法可以短時間內(nèi)快速篩查布魯氏菌，如果將這兩種方法結(jié)合起來，可以更有效地檢測樣品。但更多有關(guān)免疫熒光檢測技術(shù)，國內(nèi)相關(guān)報道較少，需要進一步研究。膠體金免疫層析技術(shù)是一類新型標記技術(shù)，具有操作簡單、所需樣品量少、節(jié)省物力財力的優(yōu)點，更適合布病檢測，近年來也得到了較為廣泛的發(fā)展。朱明東等[21]研究發(fā)現(xiàn)該方法快速檢測布病的最佳血清用量為10 μL，檢測敏感性和特異性分別達到93.6%和94.9%，非常適合于布病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及現(xiàn)場應(yīng)用，是一種檢測布病的新手段。

2.3 分子生物學(xué)檢測

2.3.1 PCR技術(shù) PCR技術(shù)特異性強、靈敏度高、不破壞樣本、操作簡便，在布魯氏菌檢測、菌種鑒別等方面得到了越來越廣泛地應(yīng)用[22-23]。2002年Navarro等[24]利用3個引物的PCR方法檢測人布魯氏菌DNA，并對其敏感性進行比較，發(fā)現(xiàn)3個引物分別可擴增編碼流產(chǎn)布魯氏菌31 kDa基因、流產(chǎn)布魯氏菌16SrRNA序列的基因和編碼外膜蛋白的基因，但3個引物在檢測人布魯氏菌靈敏度上存在差異，檢測范圍在8 fg～20 pg。2003年王勝昌等[25]采用了PCR技術(shù)，利用內(nèi)外引物PCR及套式PCR反應(yīng)方法，提取、純化了布魯氏菌R型及S型抗原DNA，發(fā)現(xiàn)這兩種類型均出現(xiàn)了預(yù)期的擴增帶，與其相比較的其他菌株沒有擴增帶；并且這種方法靈敏性強，經(jīng)過擴增后甚至可檢測到1 pg的布魯氏菌DNA。2010年孟茹等[26]通過篩選布魯氏菌omp10、omp19、omp17、omp25、omp31和結(jié)核桿菌cfp10基因的最佳引物組合，建立二重實時定量PCR鑒別方法，利用所建立的方法及常規(guī)PCR，對24份結(jié)核痰樣、11份布魯氏菌基因粗提物及30份模擬奶樣進行檢測，發(fā)現(xiàn)與預(yù)期擴增序列同源性為100%。2012年王素華等[27]對牛布魯氏菌外膜蛋白OMP31的基因序列設(shè)計引物，對樣品進行PCR擴增后測序，發(fā)現(xiàn)符合率為99.7%；并且這種方法靈敏性高，最低可檢測出0.9 pg/μL的DNA含量。2018年杜琳等[28]利用多重PCR法，對布魯氏菌的保守抗原omp31、omp25進行檢測，擴增出了相應(yīng)的特異性片段，符合預(yù)期結(jié)果，證明通過該方法可以快速檢測出所用材料中的布魯氏菌，進而大大減少實驗時間。近年來，不同種型布魯氏菌PCR檢測鑒別方法越來越多，常見的有普通PCR、多重PCR、不同種型及生物型熒光定量PCR等，其中多重PCR和熒光定量PCR在布魯氏菌檢測中應(yīng)用廣泛，滿足了檢驗檢疫、流行病學(xué)調(diào)查、診斷等多方面的需求。隨著時代的發(fā)展，PCR技術(shù)又實現(xiàn)了與芯片技術(shù)、微流體技術(shù)等新技術(shù)的融合[29]，可同時進行大量樣品中多種病原的快速檢測和分析，大大提高了檢測效率，將更有助于布魯氏菌的快速檢測和分型[30]。

2.3.2 基因檢測技術(shù) 郭秀蘭等[31]在20世紀80年代利用DNA分子的熱變性法及濃相分子雜交法，首次建立了布魯氏菌基因檢測技術(shù)，測定了布魯氏菌18個生物型的DNA，闡明了細菌DNA基因檢測技術(shù)是一種十分準確可靠的布魯氏菌生物檢測方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過測定微生物基因的GC含量、Tm值，以及利用核酸雜交技術(shù)，可以很容易地分辨各種微生物類型，使得該方法也成為檢測布魯氏菌的一種常見、可靠的方法。

2.3.3 核酸探針與分子斑點雜交技術(shù) 該方法是通過PCR擴增差異片段，然后利用布魯氏菌疫苗株與其他菌株基因組DNA差異序列設(shè)計探針，再將其純化、變性后建立斑點雜交。2011年張?zhí)璧萚32]根據(jù)BM28保守序列設(shè)計引物和探針，建立了一種快速、高效鑒定牛布魯氏菌的TaqMan實時熒光定量PCR方法。該方法不僅靈敏、特異性強而且重復(fù)性好，因此對于臨床中的布魯氏菌快速準確檢測具有較大的應(yīng)用價值和前景。目前，關(guān)于核酸探針及分子斑點雜交技術(shù)的相關(guān)研究報道較少，但該方法的建立也為布魯氏菌的進一步檢測開辟了一條新途徑。

3 布病防治研究進展

3.1 疫苗的推廣使用

由于布病的診斷治療難度高，加之許多患者對該病不重視、治療不配合，使得布病治療的難度越來越大，所以現(xiàn)如今越來越多的研究傾向于布病疫苗的研制，這樣可以提高易感人群或牲畜免疫力，從而大大降低布病的發(fā)生概率。減毒活疫苗和突變株疫苗是現(xiàn)階段布病防治中常用的疫苗種類，但突變株疫苗的穩(wěn)定性和安全性不高，仍需進一步研究[33]。近年來，新型基因工程疫苗發(fā)展迅速。其利用基因工程技術(shù)對現(xiàn)有的優(yōu)質(zhì)疫苗進行改造得到工程菌株、重組質(zhì)粒。此外，還有DNA疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、標記疫苗等，但蛋白質(zhì)疫苗自身在機體內(nèi)無法復(fù)制，且生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高，故尚未普及。李臻等[34]對布魯氏菌M5-90疫苗株VirB2基因缺失株的構(gòu)建及鑒定研究，發(fā)現(xiàn)基因缺失株屬于標記疫苗類；此外2011年高宇哲等[15]采用基因組同源重組方法，構(gòu)建了VirB12基因缺失的M5-90疫苗株（M5-90-VirB12），表明了缺失株M5-90-VirB12保持了M5-90疫苗的免疫保護效力。總體來說疫苗效果好，安全性較高，是防治布病的一種良好手段，但仍具有一定局限性，需要每年都進行接種從而保持記憶力。

3.2 藥物治療

目前，對布病最佳的藥物治療方法尚未達成共識，主要通過選取合理的抗生素來有效降低布病的復(fù)發(fā)率。臨床應(yīng)用表明，聯(lián)合應(yīng)用氨基糖苷類和多西環(huán)素，對急性或慢性布病的治療，失敗率和復(fù)發(fā)率都處于較低水平[35]。此外中藥治療療效明確，運用靈活、藥源廣，對于慢性布病具有較大的作用。而中西醫(yī)結(jié)合治療可以更快地減輕布病患者的癥狀，縮短治療時間，最重要的是可以減輕長期應(yīng)用抗生素帶來的副作用，對于布病的治療具有很大作用。

4 展望

對于布病檢測，雖然ELISA法和分子生物學(xué)法具有較大的優(yōu)勢，其特異性引物多、結(jié)果良好、符合率較高，但目前仍處于實驗室研究層面，對于基層布病的快速檢測仍存在較大困難，且暫無統(tǒng)一的標準。近年來，雖然疫苗研發(fā)及檢測方法得到了進步，但仍需研發(fā)安全性高、副作用低、高效方便且能夠推廣應(yīng)用的檢測手段。對于布病的預(yù)防，加快新型疫苗制備，加強免疫效果評價，針對薄弱環(huán)節(jié)，加快技術(shù)創(chuàng)新，尋求更加方便、高效的技術(shù)手段尤為重要。

除此之外，布病雖近幾年維持在一個相對較穩(wěn)定水平，但總體來看，每年的發(fā)病數(shù)量仍然較高，未呈現(xiàn)顯著性下降趨勢。因此，布病防治任重道遠，需要強化政府領(lǐng)導(dǎo)和各部門職責(zé)，強化與衛(wèi)生部門信息交流，加強布病防治宣傳教育，加強醫(yī)療工作者及普通民眾對布病的認識和重視，加強動物產(chǎn)地檢疫、屠宰檢疫和流通監(jiān)管，通過各方面、各途徑的努力，有效控制我國布病流行。