王偉科，陸娜

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蔬菜研究所，杭州 310024)

秀珍菇(Pleurotuspulmonarius)隸屬于真菌門、擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科側(cè)耳屬，菇形秀小、漂亮，口感柔嫩，美味清爽，營養(yǎng)豐富，是近年來浙江省栽培面積最廣的珍稀食用菌之一，備受廣大消費者喜愛[1]。食用菌種質(zhì)資源的收集分類鑒定是選育優(yōu)良品種的前提和基礎(chǔ)。但秀珍菇菌株繁多，來源又各不相同，造成異種同名或同種異名現(xiàn)象的普遍出現(xiàn)，而傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法很難將秀珍菇菌株區(qū)別開來。因此，引入新的秀珍菇品種鑒定分析方法必不可少[2]。

近年來，分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于藥用植物及食用大型真菌的分析。主要手段有ISSR、AFLP、RFLP、RAPD等[3]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有操作簡單、模板需要量少、多態(tài)性豐富、結(jié)果記錄方便、成本低廉等優(yōu)點，在物種遺傳多樣性鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化等多個領(lǐng)域得到普遍運用[4]。我們采用ISSR技術(shù)對8個秀珍菇菌株的遺傳多樣性進(jìn)行分析鑒定，以期為秀珍菇品種選育中親本選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株S1，杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院；菌株S2，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；菌株S3，杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院；菌株S4，杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院；菌株S5，臨安鼎新生物科技有限公司；菌株S6，浙江興森科技有限公司；菌株S7，武義海興生物科技有限公司；菌株S8，桐鄉(xiāng)西岸菌業(yè)。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

培養(yǎng)基。采用PDA培養(yǎng)基(葡萄糖20 g，馬鈴薯去皮200 g，水1 000 mL，pH值自然)。

培養(yǎng)方法。將參試菌株轉(zhuǎn)接于PDA固體培養(yǎng)基中，每個菌株轉(zhuǎn)接3個平皿，于(26±1)℃條件下培養(yǎng)10 d后用于DNA提取。

1.3 基因組DNA的提取

挑取菌絲提取DNA。DNA提取采用CTAB法[5]。提取的DNA經(jīng)Nanodrop 2000 c定量和瓊脂糖凝膠電泳檢測純度后，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ISSR引物設(shè)計及合成

ISSR引物參考哥倫比亞大學(xué)公布的序列和Wolfe相關(guān)設(shè)計[6]，從中挑選出16條合適引物，引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，引物具體序列見表1。

1.5 ISSR分子標(biāo)記鑒定

ISSR擴(kuò)增體系根據(jù)各自引物退火溫度和Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后體系含10×PCR buffer 2 μL、25 mmol·L-1MgCl21.2 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL、10 mmol·L-1ISSR引物1 μL、100 ng基因組模板DNA和1 U pfu DNA聚合酶，總體積20 μL。

表1 參試菌株ISSR引物參考序列

PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s、46～52 ℃退火90 s、72 ℃延伸30 s、35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。其中，每個引物的退火溫度優(yōu)先參考值為Tm值下調(diào)2 ℃。

1.6 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

取目標(biāo)產(chǎn)物10 μL，加入6×上樣緩沖液1.5 μL，混勻后于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離，拍照記錄。

1.7 數(shù)據(jù)采集分析

從凝膠成像系統(tǒng)得到的電泳譜帶中，選取清晰可辨的電泳條帶，以1和0記錄條帶的有或者無，在相同片段位置上存在擴(kuò)增帶時，記錄為1，不存在時記錄為0，將圖形數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)。并運用NTSYS-pc2.0軟件，根據(jù)SM相似系數(shù)法計算品種間的遺傳相似性，UPGMA進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR多態(tài)性

用來擴(kuò)增秀珍菇的16條ISSR中，有8條獲得的ISSR帶型較好，各引物擴(kuò)增獲得的條帶片段大小范圍較大，在500～5 000 bp；共擴(kuò)增獲得207個DNA條帶，其中多態(tài)性條帶119條。引物P828、P974擴(kuò)增的多態(tài)性比率最高，為100%；引物P826擴(kuò)增的多態(tài)性比率最低，為15.8%(表2)。

表2 8條ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果

2.2 DNA指紋圖譜分析

在秀珍菇ISSR擴(kuò)增DNA指紋圖譜(圖1)中：引物P841、P8288分辨力最高，對秀珍菇基因組DNA擴(kuò)增效果最好；引物P828、P974擴(kuò)增條帶多態(tài)性最高，表明用該ISSR引物建立的指紋圖譜用來區(qū)分秀珍菇遺傳背景較好。

M為DNA marker；S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8為8個秀珍菇菌株圖1 8個秀珍菇菌株的8條ISSR引物擴(kuò)增圖譜

2.3 聚類分析

用NTSYS-pc2.0的UPGMA對秀珍菇ISSR結(jié)果進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，8份樣本可劃分為A和B 2大類群，其中，S1為單獨一個A類群，剩下為B類群。在B類中，遺傳相似系數(shù)為0.77處，S3單獨聚為一類，其余樣本聚為一類。在遺傳相似系數(shù)約0.82處，8份樣本可聚為4類，S1、S3各單獨聚為一類，S2、S5、S6聚為一類，S4、S7、S8聚為一類(圖2)。

圖2 8個秀珍菇樣本的UPGMA聚類結(jié)果

3 小結(jié)

秀珍菇由于長期的人工栽培和相互引種，使得秀珍菇“同種異名”“同名異種”的現(xiàn)象經(jīng)常出現(xiàn)，僅從子實體外觀形態(tài)上很難進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，這不僅影響了秀珍菇品種鑒定的準(zhǔn)確性，也會增加菇農(nóng)選擇品種的困惑[7]。因此，菌株或品種間親緣關(guān)系研究和遺傳多樣性分析對于該屬食用真菌育種和生產(chǎn)都具有較為重要的意義，不僅可減少育種工作中親本選擇的盲目性，也能使菇農(nóng)避免因栽培品種選擇錯誤而造成的經(jīng)濟(jì)損失。

16條ISSR引物對8個秀珍菇品種的擴(kuò)增結(jié)果表明，有8條ISSR引物獲得的帶型較好，多態(tài)性豐富，條帶清晰，共擴(kuò)增出207個條帶，多態(tài)性條帶119條，表明秀珍菇種質(zhì)之間存在豐富的遺傳多樣性。在DNA指紋圖譜中，引物P828、P974擴(kuò)增條帶多態(tài)性最高，表明用該ISSR引物建立的指紋圖譜可較好地區(qū)分秀珍菇遺傳背景。

UPGMA聚類分析表明，8份樣本可劃分為2大類群，其中，S1為單獨一類，其余為一類。在遺傳相似系數(shù)為約0.82處，8份樣本可聚為4類，S1、S3各單獨聚為一類，S2、S5、S6聚為一類，S4、S7、S8聚為一類。這表明ISSR分子標(biāo)記可以用于秀珍菇種質(zhì)資源遺傳關(guān)系研究，有效地揭示秀珍菇種質(zhì)資源間豐富的多態(tài)性和遺傳多樣性。