范 馨，杜 娟，楊 博，周 軍

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，四川瀘州 646000）

機體凝血功能受到促凝系統(tǒng)、抗凝系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)的共同調(diào)節(jié)，生理狀態(tài)下三大系統(tǒng)協(xié)調(diào)工作，維持凝血功能穩(wěn)定，不會形成血栓或者出現(xiàn)出血傾向。當(dāng)機體面臨炎癥打擊、缺血缺氧、酸中毒、細(xì)菌病毒感染等情況時，凝血功能出現(xiàn)異常，誘發(fā)出血或血栓形成，可能出現(xiàn)DIC、MODS等嚴(yán)重后果[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，腸缺血再灌注會損傷腸、肝、腎、腦、肺等器官乃至出現(xiàn)全身多器官功能衰竭[4]，還會激活凝血系統(tǒng)[5]，而對于腸缺血再灌注后凝血功能的具體變化鮮有研究。近年來，關(guān)于氫氣和富氫鹽水的研究涉及到各種疾病，它對缺血再灌注、膿毒血癥、糖尿病、肝性腦病、癡呆、急性肺損傷等均有治療作用，能顯著減弱腸缺血再灌注對器官組織的傷害，保護器官功能[6-10]。但關(guān)于富氫鹽水對大鼠腸缺血再灌注后凝血功能的影響少有報道，因此本實驗通過建立大鼠腸缺血再灌注模型，予以富氫鹽水干預(yù)，觀察大鼠凝血功能變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與器材

實驗動物：西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供清潔級成年雄性SD大鼠32只，體重220～250 g，許可證號為SYXK（川）2018-065，所有操作均經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審查并同意。主要實驗試劑與器材：1∶9枸櫞酸鈉抗凝管，全自動凝血儀Stago-evolution（北京斯塔高公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），富氫鹽水（青島泛潤經(jīng)貿(mào)有限公司）等。

1.2 實驗動物分組

將32只SD大鼠隨機分為4組，每組8只：生理鹽水對照組（C組），富氫鹽水對照組（H組），腸缺血再灌注組（R組），富氫鹽水處理組（R+H組）。

1.3 造模取材

造模參照本課題組既往研究[11]，如在實驗過程中遇大鼠造模失敗或意外死亡，則補足大鼠后再行造模。大鼠造模前禁食12 h，自由飲水。稱重后經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉。備皮消毒，在劍突下1 cm處，沿腹正中線開腹，尋找腸系膜上動脈（SMA）并充分暴露。C組和H組僅暴露SMA不夾閉，R組和R+H組用無創(chuàng)動脈夾夾閉SMA。R組和R+H組在腸缺血持續(xù)90 min后，再次開腹，松開動脈夾，恢復(fù)血供，造成缺血后再灌注。在再灌注開始前10 min經(jīng)尾靜脈注射富氫鹽水（10 mL/kg），生理鹽水（10 mL/kg）通過同樣的方式給予。造模完成后取距回腸末端5 cm處小腸段1 cm，并經(jīng)腹主動脈取血3 mL。

1.4 小腸黏膜病理學(xué)形態(tài)變化

小腸段經(jīng)4%多聚甲醛固定12 h后，包埋切片，行HE染色，在光學(xué)顯微鏡（×200）下觀察小腸黏膜，并根據(jù)改良Chiu's評分評價損傷程度。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：正常絨毛和腺體為0分；部分絨毛頂部改變，上皮下Gmenhagen腔開始形成為1分；上皮下Gmenhagen腔開始形成，腺體輕度損傷為2分；上皮下間隙增大，毛細(xì)血管充血為3分；上皮與固有層中度分離，腺體損傷為4分；部分頂部絨毛脫落為5分；絨毛脫落明顯，毛細(xì)血管擴張為6分；固有層絨毛脫落，腺體損傷明顯為7分；固有層開始消化、分解為8分；出血、潰瘍?yōu)?分[12]。

1.5 凝血功能檢測

血液標(biāo)本用1∶9枸櫞酸鈉抗凝管收集，在室溫靜置30 min后離心（3 000 r，10 min），取上清液（血漿）于1.5 mL EP管中，2 h內(nèi)在全自動凝血儀上機檢測以下凝血功能指標(biāo)：凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、血漿凝血酶時間（TT）、纖維蛋白原（FIB）、凝血酶原時間國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（PT-INR）。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小腸黏膜病理學(xué)形態(tài)變化及Chiu's評分

與C組相比，R組及R+H組小腸黏膜損傷程度明顯加重，Chiu's評分明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；R+H組與R組比較，小腸黏膜損傷程度減輕，Chiu's評分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；H組與C組相比，Chiu's評分沒有明顯差異（P＞0.05）。光鏡下觀察到的各組小腸黏膜如圖1所示。

圖1 各組大鼠小腸黏膜病理變化（HE染色，×200）及Chiu's評分

2.2 血漿PT、APTT、FIB、TT、PT-INR變化

各組大鼠凝血功能如圖2所示，R組及R+H組PT、APTT、TT時間均較C組延長，F(xiàn)IB水平降低，PT-INR值升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與R組相比，R+H組PT、APTT、TT時間縮短，F(xiàn)IB水平升高，PT-INR值降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；H組和C組相比，以上指標(biāo)無明顯差異（P ＞ 0.05）。

圖2 各組大鼠凝血功能相關(guān)指標(biāo)比較

3 討 論

正常機體中，促凝系統(tǒng)、抗凝系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)保持動態(tài)的生理平衡，一旦這種平衡被打破，凝血功能便會出現(xiàn)異常，可能形成血栓，亦可出現(xiàn)出血；若凝血功能紊亂持續(xù)不能得到糾正，凝血因子耗竭，血小板大量減少，可能出現(xiàn)失血性休克，也可導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血（DIC），損害心、肺、肝、腎、腦等多個器官，出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征（MODS），嚴(yán)重者死亡[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，病理狀態(tài)下凝血功能異常與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，不同炎癥狀態(tài)下，凝血功能異常程度不同[13]。因此，在各種臨床疾病診療過程中，維持凝血功能正常非常重要。

在臨床工作中，醫(yī)生對凝血功能的關(guān)注首要有以下幾個基礎(chǔ)指標(biāo)：凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、血漿凝血酶時間（TT）、纖維蛋白原（FIB）、凝血酶原時間國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（PT-INR）。PT和APTT代表凝血系統(tǒng)功能，分別反映外源性和內(nèi)源性凝血系統(tǒng)功能，二者時間延長提示出血可能，縮短提示高凝狀態(tài)；TT和FIB代表纖溶系統(tǒng)功能，變化方向通常相反，F(xiàn)IB水平升高時提示高凝，降低提示出血傾向；PT-INR值在臨床上主要用于監(jiān)測抗凝藥物使用后凝血功能的變化，當(dāng)其值高于4.0時，提示血液凝固需要很長時間，可能引起無法控制的出血。而INR值低于2.0時不能提供有效的抗凝，提示抗凝藥物也許需要調(diào)整[14]。INR大于正常值（0.8～1.2），可能出現(xiàn)出血征象，需警惕出血風(fēng)險。

腸缺血再灌注在臨床上常見，多由于腹主動脈瘤、小腸移植等手術(shù)因素或是腸系膜血栓栓塞、失血性或感染性休克、嚴(yán)重?zé)齻燃膊∫蛩卣T發(fā)，炎癥反應(yīng)是其病理生理機制中關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)[15]。在本實驗中，腸缺血90 min后再灌注2 h，小腸黏膜絨毛脫落，腺體損傷明顯，固有層充血水腫，表明造模成功。大鼠腸缺血再灌注后，凝血功能的變化表現(xiàn)為PT、APTT、TT的時間延長，F(xiàn)IB水平降低，PT-INR值增大，有出血傾向。

氫氣，自然界中存在的最小氣體分子，具有易得到、無毒性、價格低廉的特點。自2007年報道氫氣具有抗氧化能力以來，它被應(yīng)用于各種疾病的基礎(chǔ)實驗及少數(shù)臨床實驗中，故而發(fā)現(xiàn)其還具有抵抗炎癥、抑制凋亡、細(xì)胞保護等作用[9,16]。研究發(fā)現(xiàn)，氫氣對全身各大系統(tǒng)均有保護作用，如吸入氫氣可以緩解癡呆病情發(fā)展、依賴Akt/GSK3β信號通路減弱心肌缺血再灌注損傷、改善代謝綜合征、治療肺動脈高壓、治療肺吸蟲誘導(dǎo)的慢性肝炎、抗癌等[10,17-20]，富氫鹽水是氫氣溶解于生理鹽水中所得，和氫氣具有相同功能。有研究說明富氫鹽水經(jīng)腹腔注射，對腦缺血再灌注損傷的動物模型具有神經(jīng)保護作用，效果和吸入氫氣相似[8]。在本實驗中，富氫鹽水干預(yù)大鼠腸缺血再灌注模型后，小腸黏膜損傷減輕，凝血功能指標(biāo)變化減小，凝血功能異常得到一定程度的糾正，減小了出血風(fēng)險。而富氫鹽水對凝血功能正常的大鼠，不影響其凝血功能。

4 結(jié)論

在大鼠腸缺血再灌注后，小腸黏膜損傷嚴(yán)重，凝血功能發(fā)生改變，有出血傾向，富氫鹽水可以減輕小腸黏膜病理變化，并改善凝血功能異常狀態(tài)，減小出血風(fēng)險。但本研究仍存在不足之處，如小腸黏膜損傷程度與凝血功能異常程度相一致，那么兩者之間是否會存在相關(guān)性，以及富氫鹽水改善腸缺血再灌注后凝血功能異常的具體機制均有待進一步探討。