林瑩瑩 任發(fā)政 王紫薇 何雨桐 郭慧媛*

（1 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京100083 2 教育部北京市共建功能乳品重點實驗室 北京100083）

乳中體細胞數（Somatic cell count，SCC）是指每毫升乳中所含的體細胞總數[1]，是表征奶牛健康狀態(tài)的重要指標。研究表明，原料乳中SCC 的高低與酶含量具有相關性[2]。在高SCC 的原料乳中，血纖維蛋白溶酶（Plasmin，PL）及脂肪酶的活性較高，且酶的耐熱性強，這些酶可能會造成產品在貨架期內發(fā)生凝膠[3]、脂肪上浮[4]等劣變現(xiàn)象。

近年來，關于原料乳SCC 對乳制品貯藏期品質影響的研究中，Santos 等[5]發(fā)現(xiàn)原料乳SCC 的上升，會加劇巴氏殺菌乳在貯藏期內蛋白質和脂肪的水解，使貯藏期明顯縮短；Kelly[6]研究發(fā)現(xiàn)高SCC 和低SCC 原料乳生產的UHT 乳都有少量的PL 活性殘留，且β-酪蛋白和αS1-酪蛋白都發(fā)生水解，然而均未出現(xiàn)凝膠現(xiàn)象；Auldist 等[7]研究發(fā)現(xiàn)高SCC 和低SCC 原料乳生產的UHT 乳在貯藏期間都發(fā)生了膠凝現(xiàn)象，他們認為UHT 乳膠凝現(xiàn)象的出現(xiàn)與蛋白水解程度無關。付文菊[8]發(fā)現(xiàn)25 ℃和37 ℃貯藏的UHT 乳在試驗中很快出現(xiàn)了脂肪上浮，原料乳SCC 越高，UHT 乳貯存期間脂肪上浮越快。Strzalkowsk 等[9]的研究表明牛奶的脂肪水解與體細胞數和β4-防御素的多晶型形式相關。由此可見，關于體細胞數是否會引發(fā)UHT 乳蛋白質和脂肪水解，而這些水解作用又是否會造成蛋白凝膠和脂肪上浮這兩個問題尚無定論。目前，中國原料乳收購標準中的體細胞數控制標準無據可依。

針對以上問題，本試驗采集不同體細胞數的原料乳，通過間接加熱制成UHT 乳產品進行貯藏期試驗，跟蹤測定纖維溶酶活性、蛋白質水解情況及黏度，同時測定脂酶活性、游離脂肪酸含量和脂肪球結構變化情況，探究體細胞數對UHT 乳貯藏期間的蛋白質和脂肪水解的影響，以及與產品凝膠和脂肪上浮現(xiàn)象的關系。為企業(yè)制定原料乳收購的體細胞數標準提供依據，同時為UHT 乳的品質控制提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集體細胞數分別為30 萬個/mL 和80 萬個/mL 的原料乳，測定各項指標后，采用147 ℃、4 s間接滅菌法，經過無菌灌裝加工成225 mL 的利樂磚UHT 乳。兩個體細胞組各制備3 個批次的樣品，置于20 ℃下貯藏180 d，每隔30 d 取樣測定相應指標。

1.2 主要藥品和試劑

巴比妥鈉、p-硝基苯酚丁酸酯、EDTA 二鈉、對硝基苯酚、三乙醇胺、硝酸銅、三氯甲烷、銅試劑（二乙基二硫代氨基甲酸鈉）、 正丁醇、 磷酸二氫鉀，北 京 化 工 廠；PMSF、6-氨 基 己 酸（EACA）、DMF、乳用澄清劑（clarifying agent for dairy products）、n-Suc-Ala-Phe-Lys-AMC，美國sigma 公司。

1.3 主要儀器與設備

LYNX4000 型低溫高速離心機，美國Thermo Scientific 公司；RF5301 型熒光光度計、LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；KDY-9830 全自動凱氏定氮儀，上海洪紀儀器設備有限公司；AR-1500ex 型旋轉流變儀，美國TA公司；Infinite M200Pro 型多功能酶標儀，瑞士Team 公司；LS230型激光粒度分析儀，美國Backman 公司。

1.4 方法

1.4.1 纖維溶酶的測定 根據Harris 等[10]的方法進行改進，由酶解底物濃度變化反映纖溶酶活性。取1 mL 牛乳與1 mL 緩沖液混勻，室溫放置60 min 后，于37 ℃保溫10 min；取0.3 mL 混合液與0.3 mL n-Suc-Ala-Phe-Lys-AMC 溶液 （濃度為2.0 mmol/L）混勻，于37 ℃保溫；每32 min，取0.1 mL 加入1 mL 去離子水，1 mL 澄清劑，混勻后進行熒光測定。測定條件：激發(fā)波長370 nm，發(fā)射波長440 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為3 nm。共測定5 次，以測定時間為橫坐標，熒光強度為縱坐標，做出熒光強度隨時間變化的回歸曲線，斜率為纖維溶酶活性，單位為U/mL。

1.4.2 蛋白質組成的測定 采用凱氏定氮法測定樣品中的總氮、非蛋白氮和非酪蛋白氮?？偟臏y定根據國標GB50095-2010 方法測定，非蛋白氮的測定采用AOAC991.21，非酪蛋白氮的測定采用AOAC927.3。

1.4.3 酪蛋白組成的測定 采用高效液相色譜法（RP-HPLC）測定酪蛋白組成[11]，取乳樣40 mL，于4 000×g，4 ℃條件下離心20 min；除去上層脂肪，取0.4 mL 脫脂乳，加入1.6 mL 變性劑，混勻，靜置15 min；溶液過0.45 μm 水系膜；取0.2 mL 溶液進行高效液相色譜分析，設定參數：流動相A 為含有0.11%三氟乙酸的超純水，流動相B 為含有0.11%三氟乙酸的乙腈；C4 柱子 （5 μm，250 mm×4.6 mm，Kromasil）；柱溫25 ℃；進樣量60 μL；檢測波長214 nm；流速0.8 mL/min；工作時間0～40 min內，流動相B 的含量從30%升至50%；40～42 min內，從50%升至100%；42～43 min 內，維持不變；43～46 min 內，從100%降至30%，再平衡5 min；共計51 min。

1.4.4 黏度的測定 采用AR-1500ex 型旋轉流變儀，設定參數：溫度25 ℃，轉子Double gap cylinder，Gap 為4 000 mm，加樣量5 mL。程序設置：預攪5 min，剪切速率從1 rad/s 升至100 rad/s；隨后固定在100 rad/s，每10 s 測定一次黏度，共測定12 次，單位為mPa·s。

1.4.5 游離脂肪酸（FFA）的測定 采用銅皂法測定游離脂肪酸，具體步驟參照Ma 等[12]的方法。

1.4.6 pH 值的測定 采用梅特勒Delta320 型酸度計于室溫下測定。

1.4.7 脂肪酶活性的測定 根據張樹利[13]的方法進行改進，樣品經低溫離心脫脂，得到脫脂乳，0.5 mL 脫脂乳與2 mL 巴比妥緩沖液混勻，37 ℃保溫15 min，加入底物50 μL，混勻后，37 ℃保溫10 min，隨后加入2 mL 酶抑制劑，混勻后于37 ℃水浴3～5 min。取出并吸取上述混合物200 μL 于酶標板內，采用酶標儀測定420 nm 處的吸光值。

1.4.8 粒徑分布的測定 將200 μL 乳樣注入到粒度分析儀中，在含100 mL 水的測定裝置中稀釋，當濃度達到8%時開始測定。利用動態(tài)光散射得到樣品中的乳脂肪球粒徑分布，并根據公式計算出其體積平均直徑（d4，3）。

1.4.9 激光共聚焦顯微鏡（CLSM）測定脂肪球膜取樣品乳45 mL，于3 000×g 條件下離心5 min，取0.02 g 脂肪，溶于模擬牛乳超濾液成脂肪球稀釋液。取1 μL 尼羅紅和快綠染料與200 μL 樣液輕柔混勻，避光染色1 h。吸取10 μL 染好色的待測樣，加20 μL 低熔點瓊脂糖（質量分數0.5%）。然后在激光共聚焦顯微鏡上觀察樣品脂肪球膜狀態(tài)，觀察條件：Ar/Kr 激光源，63 倍目鏡，熒光模式，尼羅紅激發(fā)光源波長288 nm，快綠的激發(fā)光源波長633 nm，圖片大小設置為512×512 像素。

1.4.10 數據處理方法 所有測定指標均重復3次，試驗數據采用Excel（Microsoft Inc.，2013）整理和作圖，采用SPSS Statistics（Version 21）統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，數值以平均值±標準差表示，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 原料乳的各項指標測定結果

6 批原料乳的各項指標結果見表1。低體細胞數組（LSCC）和高體細胞數組（HSCC）除體細胞數外，其余指標無差異。

表1 原料奶信息Table1 Information of raw milk

2.2 UHT 乳在貯藏期間的酶活性變化

由圖1a 可知，兩組UHT 乳在貯藏期間檢測到的PL 活性都很低，穩(wěn)定在0.01～0.06 U/mL 之間，而原料乳中PL 酶活分別是（6.00±0.01）U/mL和（8.23±0.10）U/mL，說明本試驗采用的間接UHT方式，加熱強度大，原料乳經過UHT 殺菌后，乳中的PL 基本完全失活，貯藏期間一直很低；這與Newstead 等[14]的報道一致，該研究中指出，UHT 間接加熱殺菌比直接加熱殺菌強度更大，經間接加熱殺菌的UHT 乳中PL 基本完全失活。另外，在Huppertz 等[15]的報道中指出，β-乳球蛋白在經過UHT 加熱后會發(fā)生變性，變性的β-乳球蛋白會與酪蛋白結合生成酪蛋白-β-乳球蛋白復合物，這種復合物會對PL 的活性有所抑制。這可能是本試驗UHT 乳中PL 活性很低的原因之一。

經UHT 殺菌后，盡管PL 大部分被滅活，然而，在貯藏過程中殘余的少量纖維溶酶酶原（PG）會被激活轉化成PL。有報道表明，原料乳中PG 的含量隨體細胞數的升高而升高[16]。因此，本研究中HSCC 組殘留的PG 較高，在貯藏過程中逐漸轉化為PL，故在貯藏第5、6 個月時，HSCC 組的PL 值高于LSCC 組。

圖1 UHT 乳在貯藏期內的纖維溶酶和脂肪酶活性的變化Fig.1 Changes in plasmin and lipase activity of UHT milk with different SCC during storage period

由圖1b 結果顯示，兩組體細胞數組的原料乳經過UHT 處理后，脂肪酶活性在0.03～0.06 U/mL之間，兩組無顯著性差異（P＞0.05）。原料乳中高、低體細胞組的脂肪酶活性分別是50.20±1.74 U/mL 和62.46±2.14 U/mL，可見經過UHT 處理后，脂肪酶活性大大降低。這與Choi 和付文菊等[17，9]報道相符，經過UHT 處理后，脂肪酶僅能保持少量的活性。此外，在UHT 乳貯藏期間，所有樣品中的脂酶活性都沒有顯著性變化（P＞0.05）。

2.3 UHT 乳貯藏期間的蛋白水解

2.3.1 蛋白水解情況 UHT 乳貯藏期間以非蛋白氮占總氮的百分比（NPN/TN）表示真蛋白水解程度，以非酪蛋白氮占總氮的百分比（NCN/TN）表示酪蛋白水解程度。由圖2可知，在UHT 乳貯藏期間，NPN/TN、NCN/TN 總體呈上升趨勢，而從第5個月起兩組樣品的蛋白水解率和酪蛋白水解率開始出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），說明UHT 乳的蛋白水解程度隨體細胞數的上升而加劇。

圖2 UHT 乳在貯藏期內的NPN/TN 和NCN/TN 的變化Fig.2 Changes in NPN/TN and NCN/TN of UHT milk with different SCC during storage

2.3.2 各酪蛋白組分的水解情況 通過高效液相色譜法進行酪蛋白成分的分析，以此觀察各酪蛋白組分的水解情況。由圖3所示，在貯藏期間兩組UHT 乳的各個酪蛋白組分均發(fā)生不同程度的水解，其中κ-酪蛋白和αS2-酪蛋白的水解程度最高，在貯藏第6 個月結束時，κ-酪蛋白和αS2-酪蛋白完整蛋白的峰面積降幅高達90%以上。

由圖3a 和3b 可知，在貯藏期開始時HSCC組β-酪蛋白和αS1-酪蛋白的水解率略低于LCSS組，從第4 個月起β-酪蛋白和αS1-酪蛋白的水解率顯著高于LSCC 組（P＜0.05），這可能是由于在貯藏后期HSCC 組的PL 活性高于LSCC 組，因此引發(fā)酪蛋白水解更為劇烈。由圖3c 和3d 可知，兩組樣品的κ-酪蛋白和αS2-酪蛋白的水解程度無顯著性差異（P＞0.05），并且兩種酪蛋白的水解率在貯藏期的前4 個月均大幅上升，由于兩體細胞組的原料乳中均有一定數量的嗜冷菌，故可推測嗜冷菌產生的蛋白酶也參與了蛋白水解。

2.3.3 UHT 乳貯藏期間的黏度變化 黏度是蛋白凝膠的表觀指標，Kocak 等[18]發(fā)現(xiàn)當UHT 乳在貯藏期間的黏度突然躍升到10 mPa·s 以上時，表明出現(xiàn)了蛋白膠凝特性。

從圖4可知，兩組樣品的黏度沒有顯著性差異（P＞0.05），均始終穩(wěn)定在2.0～2.4 mPa·s 之間，沒有出現(xiàn)突然躍升現(xiàn)象，說明兩組樣品均未出現(xiàn)蛋白凝膠現(xiàn)象。因此，UHT 乳中的酪蛋白雖然在貯藏期間發(fā)生了明顯水解，但是蛋白水解片段之間并沒有發(fā)生互相交聯(lián)，沒有形成凝膠。Kohlmann[19]和Kelly[6]通過試驗證明，若乳中PL 活性很低或失活的情況下，不會引起UHT 乳膠凝現(xiàn)象，與本試驗結果一致。

圖3 UHT 乳在貯藏期內的（a）β-酪蛋白、（b）αS1-酪蛋白、（c）κ-酪蛋白、（d）αS2-酪蛋白的水解程度Fig.3 Degree of hydrolysis of （a） β-casein、（b） αS1- casein、（c） κ- casein and （d） αS2-casein of UHT milk during storage

貯藏期間，從酪蛋白膠束上水解釋放下來的κ-酪蛋白與乳清中的β-乳球蛋白發(fā)生結合，形成β-κ-復合物，只有當β-κ-復合物在乳清相中聚集交聯(lián)到一定程度才會形成凝膠，引發(fā)體系的黏度上升。結合本研究蛋白和酪蛋白水解的試驗結果可以發(fā)現(xiàn)，盡管從液相色譜的結果可知兩組樣品中的酪蛋白在貯藏后期大量水解，失去了原有完整結構，然而體系中的NCN/TN 僅由6.26%±0.08%、6.10%±0.12%上升到7.86%±0.35%、8.15%±0.30%，表明酪蛋白的水解程度并不高，即水解產生的片段仍然存在于酪蛋白膠束中，沒有進入到乳清相中變成可溶性氮。也正是由于這個原因，使得乳清相中沒有形成足夠的β-κ-復合物，因此沒有形成凝膠。也有文獻表明在UHT 間接加熱時，由于加熱強度大，β-乳球蛋白變性，使其變得穩(wěn)定，并且乳清蛋白會附在酪蛋白表面，不僅會減少凝膠的位點，還能與酪蛋白結合生成抑制PL 活性的酪蛋白-β 乳球蛋白復合物，進而阻止UHT 乳的凝膠[20]。

2.4 UHT 乳貯藏期間的脂肪水解

2.4.1 UHT 乳貯藏期內的游離脂肪酸變化 在貯藏期間，脂肪水解程度用游離脂肪酸（FFA）含量來表示，如圖5所示，兩組UHT 乳的游離脂肪酸含量略有上升，然而與貯藏初期相比并無顯著性差異（P＞0.05），即體系中的脂肪酶活性很低，因此盡管脂肪球表面的酪蛋白層發(fā)生水解，其內部的甘油三酯并未發(fā)生明顯水解，樣品中的游離脂肪酸增加不明顯。Fernandes 等[21]在對貯藏期UHT 奶脂解情況的研究中也得到了相似結論，他們認為原料乳SCC 和貯藏期內UHT 乳中FFA 含量的關聯(lián)性并不顯著。

在6 個月的貯藏期中，各體細胞數pH 值均呈降低趨勢。一般而言，脂肪水解生成的游離脂肪酸會使乳體系的酸度增加，然而從本研究結果來看，游離脂肪酸在增加酸度方面作用有限，僅使pH 值從6.8 下降到約6.5。

2.4.2 UHT 乳貯藏期間的脂肪球聚集情況 由圖6可以看出，經過6 個月的貯藏期，HSCC 組包裝盒頂部出現(xiàn)2～3 mm 的脂肪層，而LSCC 組包裝盒頂部并未出現(xiàn)脂肪層。由圖6可知，經過均質的UHT 乳在剛剛進入貯藏期時，乳中脂肪球的粒徑分布為0.48～0.55 μm，隨著貯藏時間的延長，脂肪球粒徑出現(xiàn)明顯增加。d4，3是基于體系中粒子體積計算得到的直徑，該值對大直徑粒子的變化更敏感，因此更適合用來表征脂肪球的變化。從d4，3粒徑觀測結果（圖7b） 來看，UHT 乳脂肪球在第2個月粒徑迅速增加，之后無明顯變化。

圖4 兩組體細胞組UHT 乳在貯藏期內的黏度變化Fig.4 Changes in viscosity of UHT milk with different SCC during storage period

圖5 UHT 乳在貯藏期內的游離脂肪酸含量變化Fig.5 The content change of free fatty acids of UHT milk during storage

圖6 貯藏6 個月后的LSCC 組（a）和HSCC 組（b）的包裝盒頂部脂肪層Fig.6 Top of the box fat layer of LSCC UHT milk （a） and HSCC UHT milk （b） after 6 months

圖7 HSCC 組在6 個月的貯藏期粒徑分布圖和兩組UHT 乳在貯藏期間d4，3 的變化Fig.7 The particle diameter distribution of HSCC milk during 6 months and d4，3 change of UHT milk during storage

UHT 乳經均質處理后，脂肪球的粒徑變小，酪蛋白能在油水界面之間分散并覆蓋在脂肪球表面形成蛋白層，使脂肪球均勻穩(wěn)定地分散在乳中。UHT 乳貯藏過程中，乳中的蛋白酶能夠水解酪蛋白，破壞乳脂肪球表面覆蓋的酪蛋白層，引起脂肪球之間的聚集，最終發(fā)生相分離而出現(xiàn)脂肪上浮[13，22-23]。因此，可以通過對脂肪球形態(tài)和球膜完整性的觀測，來了解脂肪球聚集情況。

用尼羅紅和快綠對乳脂肪球和蛋白進行雙染色，采用共聚焦顯微鏡觀察，圖像中紅色為脂肪球，綠色是蛋白質，從圖8a-8c 中可看出，在貯藏初期，UHT 乳體系中的脂肪球基本呈分散狀態(tài)，且脂肪球膜上的綠色蛋白膜完整，清晰可見。經過6個月貯藏期，HSCC 組脂肪球表面的蛋白膜崩解，脂肪球互相黏連，聚集成團簇；而LSCC 組雖然也發(fā)生脂肪球膜蛋白水解，但是脂肪球并未出現(xiàn)顯著聚集現(xiàn)象。脂肪球的聚集使得脂肪上浮，最終在UHT 乳的包裝盒頂部形成脂肪層[23]。

圖8 貯藏期開始（a）及6 個月后的LSCC 組（b）和HSCC 組（c）的乳脂肪球激光共聚焦顯微圖像Fig.8 Confocal laser scanning microscopy images of stained MFG of milk at the storage starting point （a）and after 6 months （b：LSCC UHT milk，c：HSCC UHT milk）

3 總結

研究結果表明，在間接UHT 加熱方式處理條件下，UHT 乳在20 ℃貯藏6 個月發(fā)生了明顯的蛋白水解，然而并沒有形成蛋白凝膠；80 萬個/mL 體細胞組在第4 個月以后出現(xiàn)了明顯的脂肪上浮現(xiàn)象，而30 萬個/mL 組沒有發(fā)生脂肪上浮。因此，體細胞數是影響UHT 乳脂肪球穩(wěn)定性的重要原因。為了保證UHT 乳的貯藏品質，建議在生產UHT乳時，應選用體細胞數低于30 萬個/mL 的原料乳。

致謝：感謝中荷奶業(yè)發(fā)展中心的資助（資助編號SDDDC2014R01）。